Modelo de xenoinjerto heterogéneo derivado del paciente del cáncer de páncreas utilizando larvas de pez cebra como anfitriones para la evaluación comparativa de fármacos

Summary

Este protocolo describe los procedimientos de optimización en un modelo de xenoinjerto tumoral doble etiquetado con fluorescencia doble basado en virus utilizando peces cebra larvales como huéspedes. Este modelo heterogéneo de xenoinjerto imita la composición tisular del microambiente del cáncer de páncreas in vivo y sirve como una herramienta más precisa para evaluar las respuestas de los medicamentos en modelos personalizados de xenoinjerto derivado del paciente de pez cebra.

Abstract

El xenoinjerto tumoral derivado del paciente (PDX) y el xenoinjerto tumoral derivado de células (CDX) son técnicas importantes para la evaluación preclínica, la orientación de medicamentos y las investigaciones básicas sobre el cáncer. Las generaciones de modelos PDX en ratones huésped tradicionales consumen mucho tiempo y solo funcionan para una pequeña proporción de muestras. Recientemente, el pez cebra PDX (zPDX) ha surgido como un sistema anfitrión único, con las características de pequeña escala y alta eficiencia. Aquí, describimos una metodología optimizada para generar un modelo de xenoinjerto tumoral con etiqueta de fluorescencia dual para la evaluación comparativa de quimioterapia en modelos zPDX. Las células tumorales y los fibroblastos se enriquecieron a partir de tejido de cáncer de páncreas recién cosechado o congelado en diferentes condiciones de cultivo. Ambos grupos celulares fueron etiquetados por lentivirus que expresan proteínas fluorescentes verdes o rojas, así como un gen antiapoptosis BCL2L1. Las células transtrinfectadas fueron premezcladas y co-inyectadas en el pez cebra larval de 2 dpf que luego fueron criados en medio E3 modificado a 32 oC. Los modelos de xenoinjerto fueron tratados por medicamentos de quimioterapia y/o inhibidores de BCL2L1, y las viabilidades de las células tumorales y fibroblastos se investigaron simultáneamente. En resumen, este protocolo permite a los investigadores generar rápidamente una gran cantidad de modelos zPDX con un microambiente tumoral heterogéneo y proporciona una ventana de observación más larga y una cuantificación más precisa en la evaluación de la eficiencia de los candidatos a fármacos.

Introduction

La oncología de precisión tiene como objetivo encontrar las estrategias terapéuticas más beneficiosas para el paciente individual¹. Actualmente, se proponen numerosos modelos preclínicos como el cultivo primario in vitro, el cultivo organoide in vitro²y los xenoinjertos derivados del paciente (PDX) en ratones antes o después del cultivo organoiderlo para el diagnóstico y para examinar/evaluar el potencial opciones terapéuticas³. El modelo PDX generado por la inyección de células cancerosas primarias humanas en ratones inmunes, es una de las herramientas más prometedoras para la detección personalizada de fármacos en oncología clínica^3,4. A diferencia de la línea celular cultivada in vitro, los modelos PDX generalmente preservan la integridad y la heterogeneidad del entorno tumoral in vivo, imitando mejor la diversidad y las características idiosincrásicas de los diferentes pacientes tumorales, y por lo tanto, pueden predecir la resultado médico potencial de los pacientes⁴. Sin embargo, la generación de modelos PDX en ratones requiere muestras de pacientes de alta calidad y meses de tiempo para reunir suficientes células y modelos para experimentos multigrupo, y las composiciones celulares/genéticas del xenoinjerto pueden derivar de las del original biopsiadel paciente. La tasa de éxito para el establecimiento del modelo PDX de ratones también es baja, lo que dificulta su implementación amplia en la práctica clínica. Para los pacientes que llevan cánceres rápidamente progresados como el cáncer de páncreas, es posible que no puedan obtener información valiosa de los experimentos PDX a tiempo.

En los últimos años, se ha informado que el pez cebra es un huésped potencial no sólo para los modelos CDX (xenoinjerto tumoral derivado de células), sino también para los modelos PDX^{5,6,7,8,9, 10}. Como animal modelo vertebrado, el pez cebra alberga suficientes similitudes con los mamíferos tantoen genética como en fisiología, con dos ventajas significativas: transparencia y tamaño 11 pequeño. El pez cebra también es altamente fecundidad, y cientos de larvas endogámicas se pueden obtener en pocos días de un solo par de adultos^12. Varios estudios han empleado peces cebra para generar modelos transgénicos y xenoinjertos de enfermedades oncológicas^13,14. En comparación con los xenoinjertos de ratones, los xenoinjertos de pez cebra permiten el seguimiento con una sola resolución celular. Una cierta cantidad de tejidos humanos es capaz de generar cientos de modelos PDX de pez cebra (zDRX), mientras que sólo puede ser suficiente para generar un par de ratones modelos PDX^15,16. Además, las larvas de pez cebra a 2-5 dpf ya desarrollan sistemas circulatorios completos y órganos metabólicos como el hígado y el riñón, pero no el sistema inmune^17,mientras que el saco de yema restante es un medio 3D natural, ideal para la detección de drogas, pruebas de resistencia y observaciones de migración tumoral^{6,18,19,20,21}.

Con un último intento de utilizar zPDX como una plataforma de cribado/prueba para uso clínico, aquí, describimos una propuesta optimizada para el modelo zPDX de cáncer pancreático, que permite la evaluación de fármacos candidatos in vivo en poco tiempo utilizando menos células a costos más bajos. En comparación con las referencias anteriores sobre zPDX^6,9,10, introdujimos varias optimizaciones para hacer el sistema más factible y confiable para el diagnóstico clínico personalizado: 1) pre-ordenar diferentes células grupos en los tejidos tumorales primarios y células primarias estabilizadoras durante una semana antes de más experimentos; 2) etiquetar las células humanas y mejorar la viabilidad celular en xenoinjerto a través de la modificación genética basada en lentivirus; 3) optimizar la condición de cultivo de peces cebra tanto en suplementos de nutrición (glucosa y glutamina) como en la temperatura; 4) cuantificar las respuestas de los fármacos de diferentes tipos de células de manera comparativa. También realizamos cambios en la solución de inyección añadiendo varios materiales suplementarios. En conjunto, estas mejoras ofrecen la posibilidad de generar rápidamente un xenoinjerto más paciente en los huéspedes de peces cebra que se puede utilizar como una herramienta confiable para evaluar la respuesta de los fármacos candidatos.

Protocol

Todos los procedimientos animales fueron aprobados y siguieron las directrices del Comité de ética animal de la Universidad de Fudan y todos los especímenes de cáncer de páncreas se obtuvieron del Centro Oncológico de la Universidad Fudan de Shanghái. La aprobación ética se obtuvo del Comité de ética de la FUSCC, y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada paciente. 1. Preparación del equipo para la microinyección Preparación de la placa de inye…

Representative Results

En la Figura 1se representa un esquema del procedimiento. En resumen, las células del tejido del cáncer primario se sembraron en el medio completo después de la digestión con o sin la adición de inhibidores del fibroblasto del cáncer de páncreas. Las células cancerosas y los fibroblastos se enriquecieron como dos poblaciones distintas que los fibroblastos dominaron sin inhibidores, y el crecimiento de las células cancerosas prevaleció después de la…

Discussion

Tanto los modelos PDX como CDX son plataformas vitales en el campo de la biología tumoral^22,y el paso crítico de un trasplante entre especies exitoso es mejorar la supervivencia del xenoinjerto.  Recientemente, algunos estudios han demostrado que la expresión transitoria de BCL2L1 (BCL-XL) o BCL2 puede mejorar significativamente la viabilidad de las células madre embrionarias humanas en los huéspedes de ratones sin afectar las identidades celulares y los destinos<s…

Materials

DMEM	GIBCO	C11995500BT
FBS	Hyclone	sv30087.03
Y-27632	Cliniscience	Y0503	Rho kinase inhibitor
Primocin	invivogen	ant-pm-1	an antibiotic for primary cell cultures
Putrescine dihydrochloride	Sigma	P5780
Nicotinamide	Sigma	N3376
penicillin streptomycin	GIBCO	15140122.00
phosphate buffer (PBS)	GIBCO	C10010500CP
HBSS	GIBCO	14170112.00
collagenase type IV	GIBCO	17104019.00
hyaluronidase	Sigma	H3884
DnaseⅠ	Sigma	D5025
insulin	Sigma	I9278
b-FGF	GIBCO	PHG0264
EGF	GIBCO	PHG0314
pancreatic cancer fibroblasts inhibitor	CHI Scientific	FibrOUT
0.45 μm sterile filter	Millipore	SLHV033RB
concentration column	Millipore	Millipore UFC910008	Concentrate the virus
polybrene	Sigma	H9268
Hyaluronic Acid Sodium Salt	Sigma	H7630
L-glutamine	GIBCO	21051024.00
gemcitabine	Gemzan
methylcellulose	Sigma	M0262
Navitoclax(ABT-263)	Selleck	S1001	Bcl-xL inhibitor
Equipment
Microinjector	NARISHIGE
stereomicroscope	OLYMPUS	MVX10
Confocal Microscope	LEICA	SP8	0.00