Patientenabgeleitetes heterogenes Xenograft-Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs mit Zebrafischlarven als Wirte für vergleichende Arzneimittelbewertung
Summary
Dieses Protokoll beschreibt Optimierungsverfahren in einem virusbasierten Dual-Fluoreszenz-markierten Tumor-Xenograft-Modell unter Verwendung von Larvenzebrafischen als Wirte. Dieses heterogene Xenograft-Modell imitiert die Gewebezusammensetzung der Mikroumgebung von Bauchspeicheldrüsenkrebs in vivo und dient als präziseres Werkzeug zur Beurteilung von Arzneimittelreaktionen in personalisierten zPDX-Modellen (Zebrafish Patient-derived xenograft).
Abstract
Patienten-abgeleitetes Tumorxenograft (PDX) und zellabgeleitetes Tumorxenograft (CDX) sind wichtige Techniken für die präklinische Bewertung, Medikationsberatung und grundlegende Krebsforschung. Generationen von PDX-Modellen in traditionellen Wirtsmäusen sind zeitaufwändig und arbeiten nur für einen kleinen Teil der Proben. In letzter Zeit hat sich zebrafish PDX (zPDX) zu einem einzigartigen Wirtssystem entwickelt, mit den Eigenschaften von klein und hoch effizient. Hier beschreiben wir eine optimierte Methodik zur Erzeugung eines dualen fluoreszenzmarkierten Tumor-Xenograft-Modells zur vergleichenden Chemotherapie-Bewertung in zPDX-Modellen. Tumorzellen und Fibroblasten wurden aus frisch geerntetem oder gefrorenem Bauchspeicheldrüsenkrebsgewebe unter verschiedenen Kulturbedingungen angereichert. Beide Zellgruppen wurden durch Lentivirus mit grünen oder roten fluoreszierenden Proteinen sowie einem Anti-Apoptose-Gen BCL2L1gekennzeichnet. Die transfizierten Zellen wurden vorgemischt und in die 2 dpf Larvenzebrafische mitinjiziert, die dann in modifiziertem E3-Medium bei 32 °C gezüchtet wurden. Die Xenograft-Modelle wurden mit Chemotherapie-Medikamenten und/oder BCL2L1-Hemmern behandelt, und die Viabilitäten von Tumorzellen und Fibroblasten wurden gleichzeitig untersucht. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll es Forschern ermöglicht, schnell eine große Menge an zPDX-Modellen mit einer heterogenen Tumormikroumgebung zu generieren und bietet ein längeres Beobachtungsfenster und eine genauere Quantifizierung bei der Bewertung der Effizienz von Wirkstoffkandidaten.
Introduction
Die Präzisionsonkologie zielt darauf ab, die vorteilhaftesten therapeutischen Strategien für den einzelnen Patienten zu finden1. Derzeit werden zahlreiche präklinische Modelle wie In-vitro-Primärkultur, In-vitro-Organoidkultur2und patientenabgeleitete Xenografts (PDX) bei Mäusen vor oder nach der Organoidkultur zur Diagnose und zur Prüfung/Bewertung des Potenzials vorgeschlagen. therapeutische Entscheidungen3. PDX-Modell durch die Injektion von menschlichen primären Krebszellen in immungeschwächte Mäuse generiert, ist eines der vielversprechendsten Werkzeuge für personalisierte Arzneimittel-Screening in der klinischen Onkologie3,4. Im Gegensatz zur kultivierten Zelllinie in vitro bewahren PDX-Modelle in der Regel die Integrität und Heterogenität der In-vivo-Tumorumgebung, imitieren besser die Vielfalt und die eigenwilligen Eigenschaften verschiedener Tumorpatienten und können daher die potenzielle medizinische Ergebnisse von Patienten4. Die Generierung von PDX-Modellen bei Mäusen erfordert jedoch qualitativ hochwertige Patientenproben und Monate Zeit, um genügend Zellen und Modelle für Multi-Gruppen-Experimente zu sammeln, und die zellulären/genetischen Zusammensetzungen des Xenografts können von denen des Originals abweichen. Biopsie des Patienten. Die Erfolgsrate bei der Etablierung des PDX-Modells von Mäusen ist ebenfalls gering, was eine breite Umsetzung in der klinischen Praxis erschwert. Für Patienten, die schnell fortschreitende Krebsarten wie Bauchspeicheldrüsenkrebs tragen, sind sie möglicherweise nicht in der Lage, rechtzeitig wertvolle Informationen aus den PDX-Experimenten zu erhalten.
In den letzten Jahren wurden Zebrafische als potenzielle Wirte nicht nur für CDX-Modelle (Zell-abgeleitetes Tumor-Xenograft), sondern auch für PDX-Modelle5,6,7,8,9, 10. Als Wirbeltier-Modelltier hat Zebrafisch genügend Ähnlichkeiten mit Säugetieren sowohl in der Genetik als auch in der Physiologie, mit zwei wesentlichen Vorteilen: Transparenz und klein in Größe11. Zebrafische sind auch sehr fecundity, und Hunderte von inzuchtigen Larven können innerhalb weniger Tage von einem einzigen Paar Erwachsene12erhalten werden. Mehrere Studien haben Zebrafische verwendet, um sowohl transgene als auch Xenograft-Modelle von Krebserkrankungen zu erzeugen13,14. Im Vergleich zu Mäusexenografts ermöglichen Zebrafisch-Xenografts die Verfolgung mit Einzelzellauflösung. Eine bestimmte Menge an menschlichen Geweben ist in der Lage, Hunderte von Zebrafisch PDX-Modelle (zPDXs) zu erzeugen, während kann nur ausreichen, um ein paar Mäuse PDX-Modelle15,16zu generieren. Außerdem entwickeln die Zebrafischlarven bei 2-5 dpf bereits komplette Kreislaufsysteme und Stoffwechselorgane wie Leber und Niere, aber nicht das Immunsystem17, während der verbleibende Dottersack ein natürliches 3D-Medium ist, ideal für Dasmedikamentenscreening, Resistenztests und Tumormigrationsbeobachtungen6,18,19,20,21.
Mit dem ultimativen Versuch, zPDX als Screening/Testplattform für den klinischen Einsatz zu nutzen, beschreiben wir hier einen optimierten Vorschlag für das zPDX-Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs, das es ermöglicht, die In-vivo-Kandidaten-Arzneimittel innerhalb kurzer Zeit mit weniger Zellen zu geringeren Kosten zu untersuchen. Im Vergleich zu den bisherigen Referenzen über zPDX6,9,10haben wir mehrere Optimierungen eingeführt, um das System für die klinische personalisierte Diagnose machbarer und zuverlässiger zu machen: 1) Vorsortierung verschiedener Zellen Gruppen in den primären Tumorgeweben und stabilisierenden Primärzellen für eine Woche vor weiteren Experimenten; 2) Kennzeichnung der menschlichen Zellen und Verbesserung der Zelllebensfähigkeit in Xenograft durch Lentivirus-basierte genetische Modifikation; 3) Optimierung der Zebrafischkultur Zustand in Nutriment Ergänzungen (Glukose und Glutamin) und Temperatur; 4) Quantifizierung der Wirkstoffreaktionen verschiedener Zelltypen in vergleichender Weise. Wir haben auch Änderungen an der Injektionslösung vorgenommen, indem wir mehrere zusätzliche Materialien hinzugefügt haben. Insgesamt bieten diese Verbesserungen die Möglichkeit, schnell ein patientenähnlicheres Xenograft in Zebrafisch-Wirten zu erzeugen, das als zuverlässiges Werkzeug zur Beurteilung der Reaktion von Kandidatenmedikamenten verwendet werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sowohl PDX- als auch CDX-Modelle sind wichtige Plattformen im Bereich der Tumorbiologie22, und der entscheidende Schritt einer erfolgreichen Tierübergreifenden Transplantation ist die Verbesserung des Überlebens des Xenografts. Kürzlich haben einige Studien gezeigt, dass die transiente Expression von BCL2L1 (BCL-XL) oder BCL2 die Lebensfähigkeit menschlicher embryonaler Stammzellen in Mäusewirten signifikant verbessern kann, ohne die Zellidentitäten und Schicksal…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von National Natural Science Foundation of China 81402582, Natural Science Foundation of Shanghai 12DZ2295100, 14YF1400600 und 18ZR1404500
Materials
| DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
| FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
| Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
| Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
| penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
| phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
| HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
| collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
| hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
| DnaseⅠ | Sigma | D5025 | |
| insulin | Sigma | I9278 | |
| b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
| EGF | GIBCO | PHG0314 | |
| pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
| 0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
| concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
| polybrene | Sigma | H9268 | |
| Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
| L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
| gemcitabine | Gemzan | ||
| methylcellulose | Sigma | M0262 | |
| Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
| Equipment | |||
| Microinjector | NARISHIGE | ||
| stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |
Referências
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