Um modelo de Xenoenxerto derivado do paciente com melanoma

Summary

Os modelos paciente-derivados do xenograft (PDX) mais robustamente recapitular características moleculares e biológicas da melanoma e são mais preditivos da resposta da terapia comparada aos ensaios cultura-baseados tradicionais do tecido plástico. Aqui nós descrevemos nosso protocolo de funcionamento padrão para o estabelecimento de modelos novos de PDX e a caracterização/experimentação de modelos existentes de PDX.

Abstract

A acumulação de evidências sugere que as propriedades moleculares e biológicas diferem nas células de melanoma cultivadas em vasos de cultura de tecido bidimensional tradicionais versus in vivo em pacientes humanos. Isto é devido à seleção de gargalo de populações clonais de células de melanoma que podem crescer de forma robusta in vitro na ausência de condições fisiológicas. Além disso, as respostas à terapia em culturas bidimensionais do tecido no geral não refletem fielmente as respostas à terapia em pacientes com melanoma, com a maioria dos ensaios clínicos não mostrar a eficácia das combinações terapêuticas mostradas para ser eficaz em Vitro. Embora o xenotransplantar de pilhas da melanoma em ratos forneça o contexto in vivo fisiológico ausente dos ensaios bidimensionais da cultura do tecido, as pilhas do melanoma usadas para o Engraftment têm-se submetido já à seleção do gargalo para as pilhas que poderiam crescer condições bidimensionais quando a linha celular foi estabelecida. As alterações irreversíveis que ocorrem como consequência do gargalo incluem mudanças nas propriedades de crescimento e invasão, bem como a perda de subpopulações específicas. Portanto, modelos que melhor recapitulam a condição humana in vivo podem melhor prever estratégias terapêuticas que efetivamente aumentam a sobrevida global de pacientes com melanoma metastático. A técnica paciente-derivada do xenograft (PDX) envolve a implantação direta de pilhas do tumor do paciente humano a um receptor do rato. Desta maneira, as pilhas do tumor são crescidas consistentemente tensões physiological in vivo e nunca submetem-se ao gargalo bidimensional, que preserva as propriedades moleculars e biológicas atuais quando o tumor estava no paciente humano. Notáveis, os modelos PDX derivados de sítios de órgãos de metástases (i.e., cérebro) exibem capacidade metastática semelhante, enquanto os modelos PDX derivados de pacientes com terapia ingênua e pacientes com resistência adquirida à terapia (i.e., terapia com inibidores BRAF/MEK) apresentam sensibilidade semelhante à terapêutica.

Introduction

Os modelos pré-clínicos são críticos para todos os aspectos da pesquisa translacional do câncer, incluindo a caracterização da doença, a descoberta de vulnerabilidades acionáveis exclusivas do câncer versus células normais e o desenvolvimento de terapias eficazes que exploram essas vulnerabilidades para aumentar a sobrevida global dos pacientes. No campo de melanoma, dezenas de milhares de modelos de linha celular têm sido amplamente utilizados para triagem de drogas, com > 4000 contribuíram pelo nosso grupo sozinho (série WMXXX). Estes modelos de linha celular foram derivados de pacientes com melanoma com várias formas de melanoma cutâneo (ou seja, propagação Acral, Uveal e superficial) e genótipos diversos (i.e., BRAF^V600-Mutant e neuroblastoma RAS viral oncogene homólogo [ Nras ^Q61R-mutante]), que abrangem o espectro da doença presente na clínica^1,2.

Inequivocamente, a estratégia de terapia mais bem sucedida e direcionada no campo de melanoma surgiu de 1) a caracterização genômica de tumores de pacientes identificando mutações BRAF em ~ 50% de melanomas³ e de 2) investigação pré-clínica Alavancando modelos de linha celular de melanoma⁴. A combinação do inibidor de BRAF/MEK era a administração do alimento e da droga (FDA)-aprovada em 2014 para o tratamento dos pacientes cujos os melanomas abrigam mutações de BRAF^V600E/K e vangloria-se de uma taxa de resposta de > 75%⁵. Apesar desta eficácia inicial, a resistência levanta-se ràpida em quase cada caso devido aos mecanismos intrínsecos e adquiridos múltiplas da resistência e à heterogeneidade intratumoral. Infelizmente, os modelos de linha celular não recapitulam a heterogeneidade biológica representativa quando cultivadas em cultura bidimensional em vasos plásticos, o que mascara seu potencial clinicamente preditivo quando os investigadores tentam determinar experimentalmente terapêuticas que possam ser eficazes em doentes com uma forma específica ou genótipo de melanoma⁶. Compreender como melhor modelar a heterogeneidade intratumoral paciente permitirá que os investigadores desenvolvam melhores modalidades terapêuticas que podem matar subpopulações terapia-resistentes que conduzem a falha às terapias atuais do padrão–cuidado.

Paramount para o valor preditivo limitado de modelos de linha celular é como eles são inicialmente estabelecidos. As alterações irreversíveis ocorrem na paisagem clonal do tumor quando uma suspensão da único-pilha do tumor de um paciente é crescida em vasos bidimensionais, plásticos da cultura do tecido, incluindo mudanças no potencial proliferative e invasor, a eliminação de específico subpopulações e a alteração da informação genética⁷. Os xenoenxertos em camundongos desses modelos de linhagem celular de melanoma representam a plataforma in vivo mais utilizada para estudos pré-clínicos; Entretanto, esta estratégia igualmente sofre da recapitulação pobre da heterogeneidade complexa do tumor observada clìnica. Para superar essa lacuna, tem havido um crescente interesse em incorporar modelos pré-clínicos mais sofisticados de melanoma, incluindo o modelo PDX. Os modelos PDX têm sido utilizados há > 30 anos, com estudos seminais em pacientes com câncer de pulmão demonstrando concordância entre a resposta dos pacientes aos agentes citotóxicos e a resposta do modelo PDX derivado do mesmo paciente⁸. Recentemente, houve uma movimentação para utilizar modelos de PDX como a ferramenta da escolha para investigações pré-clínicas na indústria e em centros académicos. Os modelos de PDX, por causa de sua recapitulação superior da heterogeneidade tumoral em pacientes humanos, são mais clinicamente relevantes para o uso em esforços de otimização terapêutica do que os xenoenxertos de linha celular⁹. No melanoma, há uns obstáculos imensos que contundem a gerência terapêutica da doença avançada¹⁰. Modelos PDX clinicamente relevantes têm sido utilizados para modelar a resistência clínica e identificar estratégias terapêuticas com agentes clinicamente disponíveis para o tratamento de tumores resistentes à terapia^11,12. Momentaneamente, o protocolo apresentado aqui para gerar modelos de PDX exige a implantação subcutaneous do tecido fresco dos melanomas preliminares ou metastáticos (coletados pela biópsia ou pela cirurgia) em camundongos do aceno/scid/IL2-receptor nulo (NSG). Diferentes variações na abordagem metodológica são utilizadas por diferentes grupos; Entretanto, um núcleo fundamental existe¹³.

Protocol

Os seguintes protocolos de animais seguem as diretrizes do Comitê de ética humana do Instituto Wistar e diretrizes de cuidado animal. 1. coleção do tecido do tumor do melanoma Colete o tecido tumoral (denominado passagem 0) de pacientes com melanoma por um dos seguintes métodos de cirurgia ou biópsia. Para a excisão cirúrgica do tecido, manter um mínimo de 1 g de tecido (resect metástases e lesões primárias) em meios de armazenamento de transporte (RPMI 1640 + 0,1…

Representative Results

Tecido tumoral para modelos de melanoma PDX pode vir de uma variedade de diferentes fontes e também pode ser processado por a dinâmica de crescimento de modelos individuais e o uso desejado do tecido PDX. A prioridade ao estabelecer um modelo PDX é ter material suficiente para o banco para uso futuro e DNA para caracterização (Figura 1). Uma vez que o material suficiente é banked, o tecido do tumor pode ser expandido em um de três métodos principais para c…

Discussion

Nós descrevemos nisto a geração de modelos de PDX do melanoma com o tecido paciente derivado dos tumores preliminares e metastáticos, das biópsias do núcleo, e dos FNAs. Quando engrafados diretamente em camundongos NSG, os tumores apresentam propriedades morfológicas, genômica e biológica semelhantes àquelas observadas no paciente. No caso em que apenas uma pequena quantidade de tecido está disponível para os investigadores, como muitas vezes ocorre com FNAs, a técnica PDX permite a expansão do tecido tumor…

Materials

1 M Hepes	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # H0887-100ML
100x PenStrep	Invitrogen	Cat # 15140163
1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++)	MED	Cat # MT21-023-CV
2.5% Trypsin	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # T4549-100ML	10 mL aliquots stored at –20oC
BSA	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # A9418-500G
Chlorhexidine	Fisher Scientific	Cat# 50-118-0313
Collagenase IV (2,000 u/mL)	Worthington	Cat #4189	make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1
DMSO	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # C6295-50ML
DNase	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # D4527
EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid)	Merck	Cat # 324626.25
FBS	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 16000-044
Fungizone	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 15290-018
Gentamicin	FISHER SCIENTIFIC	Cat # BW17518Z
Isoflurane	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH	Cat # 050031
Leibovitz's L15 media	Invitrogen	Cat # 21083027
Matrigel	Corning	Cat # 354230	Artificial extracellular matrix
Meloxicam	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein	Cat # 025115	1-5mg/kg, as painkiller
NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice	The Wistar Institute, animal facility		breeding
PVA (polyvinyl alcohol)	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # P8136-250G
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine	Fisher Scientific	Cat# MT10041CM
Scalpel	Feather	Cat # 2976-22
Virkon	GALLARD-SCHLESINGER IND	Cat # 222-01-06
Wound clips	MikRon	Cat #427631