Multipel skleros är en inflammatorisk demyelinierande sjukdom utan botemedel. Analys av hjärnvävnad ger viktiga ledtrådar till att förstå patogenesen av sjukdomen. Här diskuterar vi metoden och nedströms analys av MS hjärnvävnad samlats in genom en unik Rapid obduktions program i drift på Cleveland Clinic.
Vi beskriver en snabb vävnadsdonation program för personer med multipel skleros (MS) som kräver forskare och tekniker för att vara på-Call 24/7, 365 dagar om året. Deltagarna samtycker till att donera sin hjärna och ryggmärg. De flesta patienter följdes av neurologer vid Cleveland Clinic mellen Center for MS Treatment och Research. Deras kliniska kurser och neurologiska funktionsnedsättningar är väl karakteriserade. Strax efter döden transporteras kroppen till MS Imaging Center, där hjärnan skannas in situ av 3 T magnetisk resonanstomografi (MRI). Kroppen överförs sedan till obduktions rummet, där hjärnan och ryggmärgen avlägsnas. Hjärnan är uppdelad i två halvklot. En halvklot placeras omedelbart i en skivning låda och alternativa 1 cm tjocka skivor är antingen fast i 4% PARAFORMALDEHYD i två dagar eller snabbt frysta i torris och 2-metylbutan. De kort fasta hjärn skivorna lagras i en kryopreservlösning och används för histologiska analyser och immunocytokemisk detektion av känsliga antigener. Frysta skivor lagras vid-80 ° c och används för molekylär, immunocytokemisk, och in situ hybridisering/RNA scope studier. Den andra halvklotet är placerad i 4% PARAFORMALDEHYD i flera månader, placeras i skivning rutan, åter skannas i 3 T magnetisk resonans (MR) scanner och skivade i centimeter tjocka skivor. Postmortem in situ MR images (MRIs) är co-registrerade med 1 cm tjocka hjärn skivor för att underlätta MRI-patologi korrelationer. Alla hjärn skivor är fotograferade och hjärn-vit-materia lesioner identifieras. Ryggmärgen skärs i 2 cm segment. Alternativa segment är fast i 4% PARAFORMALDEHYD eller snabbt frysta. Den snabba upphandlingen av obduktion MS vävnader möjliggör patologiska och molekylära analyser av MS hjärnor och ryggmärg och patologiska korrelationer av hjärnan MRI avvikelser. Kvaliteten på dessa snabbt bearbetade efter döden vävnader (vanligtvis inom 6 h dödsfall) är av stort värde för MS forskning och har resulterat i många hög effekt upptäckter.
Ett av de bästa sätten att studera en sjukdom är att undersöka den sjuka vävnaden själv. Detta innebär utmaningar för dem som studerar sjukdomar i centralanervsystemet (CNS). Biopsier av sjuka hjärnan och ryggmärgen är extremt sällsynta och vanligtvis innebär atypiska fall. Obduktion priser för personer med CNS-sjukdomar har minskat dramatiskt under de senaste åren, och när de utförs, de ofta inte ger snabb upphandling av vävnader. Dessa utmaningar har resulterat i inrättandet av sjukdomscentrerad hjärn banker, inklusive flera fokuserade på att samla vävnader från individer med multipel skleros (MS). MS är en inflammatorisk-medierad sjukdom i CNS som förstör myelin, oligodendrocyter (myelin bildar celler), nervceller, och axoner. Majoriteten av MS-patienter har en bi-fasisk sjukdom kurs som börjar med anfall av neurologiska funktionshinder med varierande återhämtning som så småningom utvecklas till en gradvis progressiv sjukdom som sannolikt neurodegenerativa i naturen1. För majoriteten av donerade MS hjärnor, efter döden intervall (PMI) mellan död och vävnads behandling överstiga 24 h. Även om dessa vävnader har gett värdefull information om patologiska förändringar i MS hjärnor, de är inte lämpade för mer avancerade molekylära studier som kan ge kraftfulla insikter i sjukdomens patofysiologi. Detta gäller särskilt gen profilerings studier, som kräver intakt RNA.
För att övervinna de begränsningar som diskuterats ovan, har vi utvecklat en snabb vävnadsdonation program som möjliggör MRI/patologiska korrelationer. Detta protokoll ger välbevarade vävnader som lämpar sig för moderna molekylära studier och möjliggör direkt jämförelse av hjärnans patologi och MRI-avvikelser i MS Brains. The Cleveland Clinic multipel skleros vävnads donation program har funnits i över 20 år. Detta snabb vävnadsdonation program anskaffas hjärnor och ryggmärg från individer med MS och andra associerade autoimmuna neurologiska tillstånd. Programmet syftar till att få in situ-MRIs inom 6 h dödsfall, följt av avlägsnande av hjärna och ryggmärg för vävnads behandling.
Rekrytering
Donationer erhålls genom antingen före slakt samtycke som erhållits direkt från patienter (församtyckt) eller från anhöriga efter döden. Pre-samtyckt patienter identifieras vanligtvis från den kliniska populationen vid mellen Center för multipel skleros behandling och forskning i Cleveland, Ohio. Även om preferens i rekrytering i Rapid vävnadsdonation programmet ges till patienter som har följts i longitudinella forskningsstudier, är det öppet för alla patienter som ses i centrum. Deltagare som anmäler sig före döden ges instruktioner till familjemedlemmar eller vårdgivare att kontakta forskargruppen, antingen vid tidpunkten för dödsfallet eller när döden tros vara nära förestående. Den andra metoden för individer att komma in i vävnadsdonation programmet är vid tidpunkten för döden genom samtycke av närstående. Delstaten Ohio kräver dödsfall som skall hänvisas till en federally-bemyndigade organ upphandling organisation som heter LifeBanc, som verkar i 20 län i nordöstra Ohio. LifeBanc skärmar alla dödsfall för en diagnos av MS, vilket är ett undantag för organdonation. Arrangemang gjordes för LifeBanc att anmäla utredare från MS vävnadsdonation program för alla dödsfall med en associerad diagnos av MS inträffar inom en 75 mil radie från Cleveland Clinic. Nästa av anhöriga och sjukhuspersonal sedan kontaktas av vävnads donation program personal och samtycke erhålls för donation av hjärna och ryggmärg vävnader. Dessa två metoder för rekrytering före slakt och obduktion genom LifeBanc resultera i cirka 10-12 hjärn donationer per år. Justeringar görs till den övre åldersgränsen för döden för att hantera antalet remisser som härrör från LifeBanc.
Anskaffning av donationer
Programmet kräver 24 h täckning, 365 dagar om året av medlemmar i vävnadsdonation program för vävnads upphandling. En centraliserad vävnadsdonation anmälan e-post/personsökare/mobil enhet text anmälan system används av den kliniska team som omfattar vävnads donationer. LifeBanc tillhandahålls nummer för att kontakta jourpersonal för vävnadsdonation programmet. Medlemmar meddelas om dödsfall av sjukhus leverantörer/anhöriga (församtyckt) eller av LifeBanc och andra remiss källor. För det första görs en bestämning av tidpunkten för dödsfallet och genomförbarheten för vävnadsdonation. Dödsfall screenas sedan för tillstånd som potentiellt kan resultera i dålig kvalitet vävnad, inklusive långvarig före slakt hypoxi, massiv destruktiv hjärnvävnad (t. ex. stora intrakraniell blödning, omfattande bi-hemisfäriska stroke, omfattande tumör förlängd ventilatorstöd (> 3 dagar), och långvarig användning av vasoaktiva medel (> 3 dagar) före döden. När en medicinsk examinator är inblandad i en död, kan studien neurolog tala med den medicinska examinator för att utforska ett sätt att få rätt tid vävnader utan att äventyra den medicinska granskarens ansvar. Om bärkraftig vävnad upplevs vara närvarande erhålls skriftligt medgivande (om det inte erhållits före slakt) och förberedelser görs för kropps transport. En tidigare kontrakterad avlidnes transporttjänst kontaktas sedan för transport till MRI-anläggningarna på Cleveland Clinic. Försiktighet iakttas för att säkerställa att kroppen förblir vid rumstemperatur och inte placeras i kylning, eftersom lägre kropps temperaturer är förknippade med förändringar i MRI signal egenskaper.
Klinisk historia
Klinisk historia innehåller uppgifter om diagnos av MS, symtomdebut, behandlingar som används, resultat av kliniska och para-kliniska tester (framkallade potentialer, cerebrospinalvätska resultat, optisk koherens tomografi), multipel skleros funktionell komposit , och utökad status skala för funktionshinder (EDSS; faktisk eller beräknad), som samlas in från läkarundersökningen (om sådan finns), och direkt intervju med närstående. Före slakt MRT samlas också in.
Vi beskriver ett protokoll som har använts för att snabbt anskaffa och bearbeta vävnad från över 150 personer med MS. Ett viktigt inslag i detta protokoll är att forskarna som utnyttjar vävnaden också ansvarar för att fastställa protokollet och utföra vävnads insamlingen. Detta ger flexibilitet när det gäller att tillgodose enskilda forskningsprojekts vetenskapliga behov. Flera aspekter av detta protokoll förbättra dess användbarhet. Patienterna är oftast väl karaktäriserade före döden, eftersom många av dem har följts av neurologer i vårt centrum. Ett kritiskt steg är bearbetningen av vävnads donationer strax efter döden, vilket ökar kvaliteten på den frusna vävnaden jämfört med vissa andra hjärn banker. Detta möjliggör molekylära studier som är av stort värde i att beskriva förändringar i transkriptionella och translationella genprodukter, som är nödvändiga för belägg för histologiska och immunocytokemiska observationer. Hävstångseffekt av morfologiska/immunocytokemiska och molekylära data över flera fall ökar tillförlitligheten i slutsatserna. Detta illustreras bäst av vår Beskrivning av mitokondriella genförändringar i hjärnbarken och neuronala genförändringar i demyeliniserade hippocampi. Nya gen profilerings protokoll håller på att utvecklas i snabb takt och den frusna vävnaden i vår bank bör tillhandahålla högkvalitativt RNA för vävnad och encellig analys.
En annan uppskattad aspekt av vårt protokoll är den korta fasta hjärn skivor. Dessa vävnader skärs i 30 μm tjocka, fritt flytande sektioner. Dessa sektioner är idealiska för att använda konfokalmikroskopi för att analysera två eller flera antigener i tre dimensioner. Goda exempel är samspelet mellan pre-myelinating oligodendrocyte processer med dystrofiska axoner i kroniska MS lesioner, samt identifiering av enstaka axonala anslutningar till transected axonal indragning lökar. Detta är i motsats till rutinmässig användning av 7 μm-tjocka paraffin sektioner, där 3D-bilder inte är genomförbara. Paraffin-inbäddade vävnader har stort värde för vissa frågor, särskilt kvantifiering av neuronala tätheter i hemisfäriska 7 μm-tjocka sektioner. Våra vävnads bearbetning protokoll är därför olika och ger flexibilitet för att säkerställa fasta och snabbt frysta vävnader.
Ett annat unikt inslag i vårt protokoll är den efter döden in situ hjärnan MRI. Brain MRIs är en oersättlig biomarkör av MS-sjukdom. Det är därför nödvändigt att fastställa de patologiska korrelat av onormala MRI-signaler. I våra studier fastställdes att både T2 och T2T1MTR ROIs ofta är myelinerade. Detta konstaterande stöder behovet av mer specifika avbildning modaliteter som tillförlitligt skilja mellan myelinerad och demyeliniserad cerebral vit materia. MRT verkar vara känslig för detektion av myelin, men våra studier visar att även en kombination av T1/T2/MTR är inte specifikt för att identifiera myelinisering. Vår efter döden protokoll ger en idealisk plattform för att testa möjligheten för nya Imaging modaliteter att skilja mellan myeliniserade och demyeliniserad cerebral vit materia. MRI ger också det ideala medlet för översättning av grundläggande vetenskapliga resultat till klinisk praxis, med tanke på användning av MRI i vår translationella forskning och dess utbredda kliniska användning hos levande patienter.
Medan skära korta och långa fasta samt frysta skivor erbjuder en fördel för bearbetning av vävnad i flera lägen för olika studier, det finns vissa begränsningar med denna metod. Att utvärdera helheten av en struktur kan vara begränsad eftersom delar av den kan bearbetas på olika sätt på intilliggande segment. Den stora volymen av vävnadsbanken, dock erbjuder möjligheten att undersöka en struktur av intresse för flera ämnen för att förbättra provtagning. En annan generell begränsning till studier som använder efter döden-vävnader är att de är tvärsnitts. I detta sammanhang måste man tolka slutsatserna om tidpunkten för och utvecklingen av förändringarna. Det kan finnas ett urval bias till patienter som donera sina vävnader, som kan begränsa generalisering av data till alla patienter med MS. Eftersom de flesta givare dör av komplikationer av avancerade MS, det kanske inte är lämpligt att extraräkna fynd från dessa patienter till de i tidigare stadier av MS. Icke desto mindre, vi har fått vävnader från yngre patienter som dog av icke-MS-relaterade villkor (dvs., akut hjärtinfarkt, överdos, självmord). Omfattningen av vårt protokoll omfattar inte provtagning av andra organ (t. ex. gastrointestinal och benmärg) som har varit inblandade i MS. Vi anser att styrkan i programmet kraftigt uppväger dess begränsningar.
The authors have nothing to disclose.
Författarna skulle också vilja tacka Dr Christopher Nelson för redaktionellt stöd. Obduktionen programmet stöds delvis av R35 Grant NS097303 till BDT. Arbetet i laboratoriet för RD stöds av bidrag från NINDS (NS096148) och det nationella multipel skleros Society, USA (RG 5298).
Antibodies | |||
Biotinylated goat anti-mouse IgG | Vector Laboratories | BA-9200 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336171 |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | BA-1000 | 1:500 dilution. |
Biotinylated goat anti-rat IgG | Vector Laboratories | BA-9400 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336208 |
Glial fibrillary acid protein (GFAP) | Dako | Z0334 | 1:700 dilution for hemispheric. RRID: AB_10013382 |
HuR, mouse IgG, 3A2 clone | Santa Cruz | SC-5261 | 1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_627770 |
Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43 | Dako | Mo746 | 1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_2313661 |
Non-phosphorylated neurofilament (SMI32) | Biolegend | 801701 | 1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30µm free-floating. RRID: AB_2564642 |
Phosphorylated neurofilament (SMI31) | Biolegend | 801601 | 1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30µm free-floating. RRID: AB_2564641 |
Proteolipid protein (PLP) | Gift from Wendy Macklin | 1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available. | |
Reagents | |||
125 mm filter paper | Whatman | 1452-125 | For filtering PFA. |
50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | Electron microscopy grade. |
Cytoseal | ThermoScientific | 8310-16 | |
Ethylene glycol | Fisher Chemical | BP230-4 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | 400mL/2L Cryoprotection solution. |
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore-Sigma | SLHV033RB | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19200 | Prills form. |
Polyvinylpyrolidone (PVP-40) | Fisher Chemical | BP220-212 | |
Sodium azide | Fisher Chemical | S227I | 2g/2L Sorenson's buffer. |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S0876 | 98.8g/2L Sorenson's buffer. |
Sodium phosphate mono basic monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | 14.352g/2L Sorenson's buffer. |
Sucrose | Sigma-Aldrich | PVP40-500G | |
VectaStain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | 1:1000 dilution of A and B. RRID: AB_2336819 |
Waterproof drawing black ink | Higgins | 44201 | |
Xylene | Fisher Chemical | X3S | Histological grade. |
Equipment | |||
3T MRI Magnetom Prisma | Siemens Healthineers | ||
7T MRI Agilent 830AS | Siemens Healthineers |