Multippel sklerose er en inflammatorisk demyeliniserende sykdom uten kur. Analyse av hjernevevet gir viktige ledetråder for å forstå patogenesen av sykdommen. Her diskuterer vi metodikk og nedstrøms analyse av MS hjernevev samlet gjennom en unik rask obduksjon program i drift på Cleveland Clinic.
Vi beskriver en rask vev donasjon program for personer med multippel sklerose (MS) som krever forskere og teknikere for å være på samtalen 24/7, 365 dager i året. Deltakere samtykke til å donere sine hjernen og ryggmargen. De fleste pasientene ble etterfulgt av nevrologer ved Cleveland Clinic Mellen Center for MS Treatment and Research. Deres kliniske kurs og nevrologiske funksjonshemminger er godt preget. Kort tid etter døden, blir kroppen transportert til MS Imaging Center, der hjernen skannes in situ av 3 T magnetisk resonans imaging (MRI). Kroppen blir deretter overført til obduksjon rommet, der hjernen og ryggmargen er fjernet. Hjernen er delt inn i to halvkuler. En halvkule er umiddelbart plassert i en skjære boks og alternative 1 cm-tykke skiver er enten fast i 4% paraformaldehyde i to dager eller raskt frosset i tørr is og 2-methylbutane. De korte faste hjerne stykkene lagres i en kryonisk bevaring løsning og brukes til histologiske analyser og immunocytochemical deteksjon av følsomme antigener. Frosne skiver lagres ved-80 ° c og brukes for molekylær-, immunocytochemical-og in situ hybridisering/RNA omfangs studier. Den andre halvkule er plassert i 4% paraformaldehyde i flere måneder, plassert i kutting boksen, re-skannet i 3 T magnetisk resonans (MR) skanner og skiver i centimeter-tykke skiver. Postmortem in situ MR bilder (MRIs) er co-registrert med 1 cm tykke hjerne skiver for å lette Mr-patologi sammenhenger. Alle hjerne skiver er fotografert og hjernen hvit-saken lesjoner er identifisert. Ryggmargen er skåret i 2 cm segmenter. Alternative segmenter er festet i 4% paraformaldehyde eller raskt frosset. Den raske anskaffelser av postmortem MS vev tillater patologiske og molekylære analyser av MS hjerner og rygg snorer og patologiske sammenhenger av hjernen MRI unormalt. Kvaliteten på disse raskt bearbeidet postmortem vev (vanligvis innen 6 h død) er av stor verdi for MS forskning og har resultert i mange høy-effekt funn.
En av de beste måtene å studere en sykdom er å undersøke den syke vevet selv. Dette presenterer utfordringer for de som studerer sykdommer i sentralnervesystemet (CNS). Biopsier av syke hjernen og ryggmargen er ekstremt sjeldne og vanligvis innebære atypiske tilfeller. Obduksjon priser for personer med CNS sykdommer har sunket dramatisk de siste årene, og når de er utført, de ofte ikke gir rask anskaffelse av vev. Disse utfordringene har resultert i etablering av sykdom-sentrert hjerne banker, inkludert flere fokusert på å samle vev fra personer med multippel sklerose (MS). MS er en inflammatorisk-mediert sykdom i CNS som ødelegger myelin, oligodendrocytes (myelin forming celler), neurons, og axons. Flertallet av MS pasienter har en bi-phasic sykdom kurs som starter med utbrudd av nevrologisk funksjonshemming med variabel utvinning som til slutt utvikler seg til en gradvis-progressiv sykdom som er sannsynlig nevrodegenerative i naturen1. For flertallet av donert MS hjerner, postmortem intervaller (PMI) mellom død og vev behandling overstige 24 h. Mens disse vev har gitt verdifull informasjon om patologiske forandringer i MS hjerner, de er ikke egnet for mer avanserte molekylære studier som kan gi kraftig innsikt i sykdoms patofysiologi. Dette er spesielt tilfellet for gen profilering studier, som krever intakt RNA.
For å overvinne begrensningene diskutert ovenfor, har vi utviklet en rask vev donasjon program som gjør det mulig for MRI/patologiske sammenhenger. Denne protokollen gir godt bevarte vev egnet for moderne molekylær studier og tillater direkte sammenligning av hjernen patologi og MRI unormalt i MS hjerner. The Cleveland Clinic multippel sklerose tissue donasjon program har eksistert i over 20 år. Denne raske vev donasjon programmet anskaffer hjerner og rygg snorer fra personer med MS og andre tilknyttede autoimmune nevrologiske tilstander. Programmet tar sikte på å oppnå in situ MRIs innen 6 h død, etterfulgt av fjerning av hjernen og ryggmargen for vevs behandling.
Rekruttering
Donasjoner oppnås gjennom enten ante-obduksjon samtykke innhentet direkte fra pasienter (pre-samtykket) eller fra nærmeste pårørende etter døden. Pre-samtykket pasienter er vanligvis identifisert fra den kliniske befolkningen ved Mellen senter for multippel sklerose behandling og forskning i Cleveland, Ohio. Selv om preferanse for rekruttering i den raske vev donasjon programmet er gitt til pasienter som har blitt fulgt i langsgående Forskningsstudier, er det åpent for alle pasienter sett i sentrum. Deltakere som melder seg før døden er gitt instruksjoner for familiemedlemmer eller omsorg tilbydere å kontakte forskerteamet, enten på tidspunktet for dødsfallet eller når døden antas å være nært forestående. Den andre metoden for enkeltpersoner å gå inn i vev donasjon programmet er på tidspunktet for dødsfallet gjennom samtykke av nærmeste pårørende. Staten Ohio krever dødsfall å bli henvist til en føderalt-mandat organ anskaffelser organisasjon kalt LifeBanc, som opererer i 20 fylker i nordøstlige Ohio. LifeBanc skjermer alle dødsfall for en diagnose av MS, som er en utelukkelse for organ donasjon. Ordninger ble gjort for LifeBanc å varsle etterforskere fra MS tissue donasjon program for alle dødsfall med en tilknyttet diagnose av MS forekommer innenfor en 75 mil radius fra Cleveland Clinic. Neste av pårørende og sykehuspersonalet blir deretter kontaktet av tissue donasjon program staff og samtykke er innhentet for donasjon av hjernen og ryggmargen vev. Disse to metodene for rekruttering ante-obduksjon og etter obduksjon gjennom LifeBanc resultere i ca 10-12 hjernen donasjoner per år. Justeringer er gjort til øvre aldersgrense for død for å administrere antall henvisninger avledet fra LifeBanc.
Anskaffelse av donasjoner
Programmet krever 24 h dekning, 365 dager i året av medlemmer av vevet donasjon program for vev anskaffelser. En sentralisert vev donasjon varsling e-post/personsøker/mobil enhet tekst varslingssystem brukes av det kliniske teamet dekker vev donasjoner. LifeBanc er gitt tall for å kontakte On-Call personell for vevs donasjon programmet. Medlemmer varsles om døden av sykehus leverandørene/nærmeste pårørende (forhåndssamtykke) eller av LifeBanc og andre henvisningskilder. Først en bestemmelse av tid for død og gjennomførbarhet til vev donasjon er gjort. Dødsfall blir deretter vist for forhold som potensielt føre til dårlig kvalitet vev, inkludert langvarig før obduksjon hypoksi, massive destruktive hjernevev (f. eks store intrakraniell blødning, omfattende bi-hemispheric slag, omfattende tumor langvarig Ventilator støtte (> 3 dager), og langvarig bruk av vasoactive midler (> 3 dager) før døden. Når en medisinsk sensor er involvert i en død, kan studien nevrolog snakke med medisinsk sensor for å utforske en måte å motta betimelig vev uten å svekke den medisinske sensor ansvar. Hvis levedyktig vev er følte å være til stede, så skriftlig samtykke er innhentet (hvis ikke innhentet pre-obduksjon) og preparater er laget for kroppen transport. En tidligere avtalt avdødes transportservice blir deretter kontaktet for transport til Mr-fasilitetene på Cleveland Clinic. Care er tatt for å sikre at kroppen forblir i romtemperatur og ikke er plassert i kulde, som lavere kropps temperaturer er forbundet med endringer i MRI-signal egenskaper.
Klinisk historikk
Klinisk historie inneholder informasjon om diagnostisering av MS, utbruddet av symptomer, behandlinger som brukes, resultater av klinisk og para-klinisk testing (fremkalt potensialer, spinalvæske resultater, optisk sammenheng tomografi), multippel sklerose funksjonell kompositt , og utvidet funksjonshemming status skala (EDSS; faktiske eller estimerte), som er samlet inn fra den medisinske posten (der det er tilgjengelig), og direkte intervju med nærmeste pårørende. Pre-obduksjon Mr er også samlet inn.
Vi beskriver en protokoll som har blitt brukt til å raskt anskaffe og behandle vev fra over 150 personer med MS. En viktig funksjon i denne protokollen er at forskerne som utnytter vevet er også ansvarlig for å etablere protokollen og utføre vev samlingen. Dette gir fleksibilitet til å møte de vitenskapelige behovene til individuelle forskningsprosjekter. Flere aspekter av denne protokollen forbedre sin nytte. Pasientene er vanligvis godt preget før døden, som mange av dem har blitt fulgt av nevrologer på vårt senter. Et kritisk skritt er behandlingen av vevet donasjoner snart etter døden, noe som øker kvaliteten på frosne vev i forhold til noen andre hjerne banker. Dette muliggjør molekylær studier som er av stor verdi i å beskrive endringer i transcriptional og translational gen produkter, som er avgjørende for sannsynliggjøring av histologiske og immunocytochemical observasjoner. Utnyttelse av morfologiske/immunocytochemical og molekylære data på tvers av flere tilfeller øker påliteligheten av konklusjoner. Dette illustreres best ved vår beskrivelse av mitokondrie gen forandringer i hjernebarken og neuronal gen forandringer i demyelinated hippocampi. Romanen genet profilering protokoller utvikles i en rask hastighet og frossen vev i vår bank bør gi høy kvalitet RNA for vev og enkelt celle analyse.
Et annet verdsatt aspekt av vår protokoll er kort-faste hjerne skiver. Disse vev er skåret i 30 μm-tykke, frittflytende seksjoner. Disse seksjonene er ideelle for bruk av konfokalmikroskopi mikroskopi for å analysere to eller flere antigener i tre dimensjoner. Gode eksempler inkluderer samspillet av pre-myelinating oligodendrocyte prosesser med dystrophic axons i kroniske MS lesjoner, samt identifisering av enkelt axonal tilkoblinger til transected axonal tilbaketrekking pærer. Dette er i motsetning til rutinemessig bruk av 7 μm-tykke parafinsnitt, der 3D-bilder ikke er gjennomførbart. Parafin-embedded vev har stor verdi for noen spørsmål, spesielt kvantifisering av neuronal tettheten i hemispheric 7 μm-tykke seksjoner. Våre vevs behandlingsprotokoller er derfor mangfoldige og gir fleksibilitet for å sikre fast og raskt frosset vev.
En annen unik funksjon i vår protokoll er den postmortem in situ hjernen MRI. Brain MRIs er en uerstattelig biomarkør av MS sykdom. Det er derfor viktig å etablere patologisk relaterer til unormale MRI-signaler. Våre studier etablerte at både T2 bare og T2T1MTR ROIs er ofte myelinated. Dette funnet støtter behovet for mer spesifikke Imaging modaliteter som pålitelig skille mellom myelinated og demyelinated cerebral hvit materie. Mr synes å være følsom for påvisning av myelin, men våre studier viser at selv en kombinasjon av T1/T2/MTR ikke er spesifikk for å identifisere myelination. Vår postmortem-protokoll gir en ideell plattform for testing av muligheten for nye bildebehandlings metoder for å skille mellom myelinated og demyelinated cerebral hvit materie. Mr gir også den ideelle bilen for oversettelse av grunnleggende vitenskap resultater i klinisk praksis, gitt bruk av MRI i vår translational forskning og utbredt klinisk bruk i levende pasienter.
Mens kutte kort-og lang-fast samt frosne skiver tilbyr en fordel for behandling av vev i flere moduser for ulike studier, er det noen begrensninger med denne metoden. Evaluering av helheten i en struktur kan begrenses fordi deler av den kan behandles annerledes på tilstøtende sektorer. Det store volumet av vevet banken, men tilbyr muligheten til å undersøke en struktur av interesse i flere for å bedre prøvetaking. En annen generell begrensning til studier utnytte postmortem vev er at de er cross-Seksjons. Konklusjoner om timing og progresjon av endringer må tolkes i denne sammenhengen. Det kan være et utvalg bias til pasienter som donerer sine vev, som kan begrense generalisering av data til alle pasienter med MS. Siden de fleste givere dør av komplikasjoner av avanserte MS, kan det ikke være hensiktsmessig å ekstrapolere funn fra disse pasientene til de i tidligere stadier av MS. Likevel har vi fått vev fra yngre pasienter som døde av ikke-MS-relaterte tilstander (dvs. akutt hjerteinfarkt, overdose, selvmord). Omfanget av vår protokoll omfatter ikke prøvetaking av andre organer (for eksempel Gastrointestinal og benmarg) som har vært innblandet i MS. Vi tror at styrkene til programmet i stor grad oppveier begrensningene.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil også gjerne takke Dr. Christopher Nelson for redaksjonell bistand. Obduksjon programmet støttes delvis av R35 gi NS097303 til BDT. Arbeid i laboratoriet av RD er støttet av tilskudd fra NINDS (NS096148) og National Multiple sklerose Society, USA (RG 5298).
Antibodies | |||
Biotinylated goat anti-mouse IgG | Vector Laboratories | BA-9200 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336171 |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | BA-1000 | 1:500 dilution. |
Biotinylated goat anti-rat IgG | Vector Laboratories | BA-9400 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336208 |
Glial fibrillary acid protein (GFAP) | Dako | Z0334 | 1:700 dilution for hemispheric. RRID: AB_10013382 |
HuR, mouse IgG, 3A2 clone | Santa Cruz | SC-5261 | 1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_627770 |
Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43 | Dako | Mo746 | 1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_2313661 |
Non-phosphorylated neurofilament (SMI32) | Biolegend | 801701 | 1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30µm free-floating. RRID: AB_2564642 |
Phosphorylated neurofilament (SMI31) | Biolegend | 801601 | 1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30µm free-floating. RRID: AB_2564641 |
Proteolipid protein (PLP) | Gift from Wendy Macklin | 1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available. | |
Reagents | |||
125 mm filter paper | Whatman | 1452-125 | For filtering PFA. |
50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | Electron microscopy grade. |
Cytoseal | ThermoScientific | 8310-16 | |
Ethylene glycol | Fisher Chemical | BP230-4 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | 400mL/2L Cryoprotection solution. |
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore-Sigma | SLHV033RB | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19200 | Prills form. |
Polyvinylpyrolidone (PVP-40) | Fisher Chemical | BP220-212 | |
Sodium azide | Fisher Chemical | S227I | 2g/2L Sorenson's buffer. |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S0876 | 98.8g/2L Sorenson's buffer. |
Sodium phosphate mono basic monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | 14.352g/2L Sorenson's buffer. |
Sucrose | Sigma-Aldrich | PVP40-500G | |
VectaStain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | 1:1000 dilution of A and B. RRID: AB_2336819 |
Waterproof drawing black ink | Higgins | 44201 | |
Xylene | Fisher Chemical | X3S | Histological grade. |
Equipment | |||
3T MRI Magnetom Prisma | Siemens Healthineers | ||
7T MRI Agilent 830AS | Siemens Healthineers |