मानव मल माइक्रोबायोटा पर इंटरवेंशनल regimens के प्रभाव का अनुमान लगाने के लिए एक इन विट्रो बैच-संस्कृति मॉडल
Summary
इस प्रोटोकॉल में मानव मल microbiota के एक इन विट्रो बैच संस्कृति किण्वन प्रणाली का वर्णन करता है, inulin का उपयोग कर (एक प्रसिद्ध prebiotic और सबसे व्यापक रूप से अध्ययन microbiota न्यूनाधिक में से एक) विशिष्ट के प्रभाव का आकलन करने में इस प्रणाली के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए मल microbiota संरचना और चयापचय गतिविधियों पर हस्तक्षेप.
Abstract
कई मानव रोगों में आंत microbiome की उभरती भूमिका नए उपकरण, तकनीक और प्रौद्योगिकियों की एक सफलता की मांग. इस तरह के सुधार मानव स्वास्थ्य लाभ के लिए microbiome न्यूनाधिक के उपयोग को समझने की जरूरत है. तथापि, माइक्रोबायोम मॉडुलन को मान्य करने और संबंधित स्वास्थ्य लाभों की भविष्यवाणी करने के लिए न्यूनाधकों की बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग और अनुकूलन बड़ी संख्या में पशुओं और/अथवा मानव विषयों की आवश्यकता के कारण व्यावहारिक रूप से कठिन हो सकता है। यह अंत करने के लिए, इन विट्रो या पूर्व vivo मॉडल microbiome न्यूनाधिक की प्रारंभिक स्क्रीनिंग की सुविधा कर सकते हैं. इसमें, यह अनुकूलित है और एक पूर्व विवो मल microbiota संस्कृति प्रणाली है कि प्रोबायोटिक्स, prebiotics और अन्य खाद्य सामग्री सहित आंत microbiome न्यूनाधिक के विभिन्न हस्तक्षेप के प्रभाव की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है का प्रदर्शन किया, एक तरफ से न्यूट्रिस्यूटिकल्स और दवाओं, विविधता और मानव आंत microbiota की संरचना पर. Inulin, सबसे व्यापक रूप से अध्ययन prebiotic यौगिकों और microbiome न्यूनाधिक में से एक, एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है यहाँ स्वस्थ मल microbiota संरचना और इसकी चयापचय गतिविधियों पर इसके प्रभाव की जांच करने के लिए, इस तरह के मल पीएच और कार्बनिक एसिड के मल के स्तर के रूप में लैक्टेट और लघु श्रृंखला फैटी एसिड (SCFAs) सहित. प्रोटोकॉल मल microbiota प्रोफाइल पर न्यूनाधिक के विभिन्न हस्तक्षेप के प्रभाव का आकलन करने के उद्देश्य से अध्ययन के लिए और उनके स्वास्थ्य प्रभावों की भविष्यवाणी करने के लिए उपयोगी हो सकता है.
Introduction
मानव माइक्रोबायोटा एक जटिल समुदाय है जिसमें बैक्टीरिया, आर्किया, वायरस और यूकैरियोटिक सूक्ष्मजीव1शामिल हैं, जो मानव शरीर में आंतरिक और बाह्य रूप से निवास करते हैं। हाल के सबूत पेट microbiota और आंत microbiome की मौलिक भूमिका की स्थापना की है (रोगाणुओं और उनके जीन मानव जठरांत्र संबंधी मार्ग में पाया के पूरे संग्रह) मोटापा सहित विभिन्न मानव रोगों में, मधुमेह, हृदय रोग, और कैंसर1,2,3. इसके अतिरिक्त, हमारे पेट में रहने वाले सूक्ष्मजीवों चयापचयों की एक विस्तृत स्पेक्ट्रम का उत्पादन जो काफी हमारे स्वास्थ्य को प्रभावित और भी कई रोगों के pathophysiology के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चयापचय कार्यों की एक किस्म के लिए योगदान कर सकते हैं4, 5.इस आंत माइक्रोबियल आबादी की संरचना और समारोह में असामान्य परिवर्तन (परेशान) को आम तौर पर “गट डिस्बिओसिस” कहा जाता है। Dysbiosis आमतौर पर मेजबान के एक अस्वास्थ्यकर राज्य के साथ जुड़ा हुआ है और इसलिए मेजबान के एक स्वस्थ नियंत्रण राज्य के साथ जुड़े सामान्य (homeostatic) माइक्रोबियल समुदाय से भेदभाव किया जा सकता है। आंत माइक्रोबायोम डिस्बिओसिस के विशिष्ट पैटर्न प्राय : विभिन्न रोगों में पाए जाते हैं1,2,3,6,7.
अपाच्य भोजन का किण्वन, विशेष रूप से किण्वित कार्बोहाइड्रेट/फाइबर, आंत माइक्रोबायोटा द्वारा न केवल ऊर्जा पैदा करता है बल्कि लघु-श्रृंखला फैटी एसिड (एससीएफएस) सहित अलग-अलग चयापचयों का उत्पादन भी करता है, लैक्टेट, फोरमेट, कार्बन डाइऑक्साइड, मीथेन, हाइड्रोजन, और इथेनॉल6| इसके अलावा, आंत microbiota भी फोलेट, बायोटिन, trimethylamine-एन-ऑक्साइड, सेरोटोनिन, tryptophan, गामा-aminobutyric एसिड, डोपामाइन, norepinephrine, एसिटाइलकोलिन, हिस्टामाइन के रूप में अन्य bioactive पदार्थों की एक संख्या का उत्पादन डिऑक्सीकॉलिक एसिड, और 4-एथिलफेनिल सल्फेट। यह मुख्य रूप से मेजबान-माइक्रोब आला के भीतर आंतरिक चयापचय फ्रलक्स के उपयोग के माध्यम से होता है, जो शरीर की कई प्रक्रियाओं, चयापचय कार्यों और एपिजेनेटिक परिवर्तन1,8,9, में योगदान देता है 10| हालांकि, ऐसे माइक्रोबियल उत्पादों पर विभिन्न हस्तक्षेपों के प्रभाव आसान, कुशल और पुन: उत्पादन योग्य प्रोटोकॉल की कमी के कारण अस्पष्ट या अस्पष्ट बने हुए हैं। मानव आंत microbiota संरचना एक अत्यंत जटिल और विविध पारिस्थितिकी तंत्र है, और इसलिए, मानव स्वास्थ्य और रोग विकृति में अपनी भूमिका के बारे में कई सवाल अभी भी अनुत्तरित रह. आंतों microbiota की संरचना और चयापचय कार्यों पर कई आम आंत microbiome न्यूनाधिक (उदा., प्रोबायोटिक्स, prebiotics, एंटीबायोटिक दवाओं, मल प्रत्यारोपण और संक्रमण) के प्रभाव काफी हद तक मायावी रहते हैं। इसके अलावा, विवो में इन प्रभावों की परीक्षा और सत्यापन मुश्किल है, विशेष रूप से क्योंकि आंत microbiota द्वारा उत्पादित पोषक तत्वों और चयापचयों के अधिकांश अवशोषित या एक साथ और तेजी से पेट में का निपटारा कर रहे हैं; इसलिए, इन चयापचयों के उत्पादन, राशि और प्रसंस्करण को मापने (जैसे, SCFAs) विवो में अभी भी एक व्यावहारिक चुनौती बनी हुई है। वास्तव में, इस तरह के जानवरों और मानव विषयों के रूप में शारीरिक मॉडल आंत microbiome और मेजबान स्वास्थ्य पर इसके मॉडुलन की भूमिका का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, लेकिन इन के कारण microbiome न्यूनाधिक के विभिन्न प्रकार के बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है नैतिक, मौद्रिक या समय की कमी। इस अंत में, इन विट्रो और/या पूर्व विवो मॉडल, जैसे कि इन विट्रो में आंत माइक्रोबायोटा की culturing और फिर विभिन्न microbiota न्यूनाधिक के साथ हस्तक्षेप, समय और पैसे की बचत के अवसरों की पेशकश कर सकते हैं और इसलिए प्रारंभिक या बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए अनुमति दे सकते हैं विभिन्न घटकों (जैसे प्रोबायोटिक्स, prebiotics, और अन्य interventional यौगिकों) मल microbiota विविधता, संरचना और चयापचय प्रोफाइल पर उनके प्रभाव की जांच करने के लिए / आंत microbiome के इस तरह के इन विट्रो और पूर्व vivo प्रणालियों का उपयोग कर अध्ययन मेजबान microbiome बातचीत है कि स्वास्थ्य और रोग की मेजबानी के लिए योगदान की आगे समझ की सुविधा हो सकती है, और यह भी उपन्यास चिकित्सा है कि लक्ष्य microbiome खोजने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं मेजबान स्वास्थ्य में सुधार और रोकने के लिए और विभिन्न रोगों का इलाज1.
हालांकि इन विट्रो आंत microbiota संस्कृति प्रणालियों वास्तव में वास्तविक आंतों की स्थिति को दोहराने नहीं कर सकते हैं, कई प्रयोगशालाओं के लिए इस तरह के मॉडल विकसित करने का प्रयास किया है, जिनमें से कुछ कुछ हद तक व्यावहारिक पाया गया है और सफलतापूर्वक के लिए इस्तेमाल किया गया है विभिन्न प्रयोजनों के लिए. हाल ही में आंत मॉडल में से एक मानव आंत्र Microbial पारिस्थितिकी तंत्र का सिम्युलेटर है, जो पूरे मानव जठरांत्र संबंधी मार्ग mimics, पेट सहित, छोटी आंत, और बृहदान्त्र के विभिन्न क्षेत्रों. हालांकि, इस तरह के तकनीकी रूप से जटिल मॉडल दुनिया भर में अन्य अनुसंधान सुविधाओं के लिए सुलभ नहीं हो सकता है। इसलिए, वहाँ अभी भी नए वैकल्पिक मॉडल है कि अपेक्षाकृत सरल, सस्ती और microbiome न्यूनाधिक और आंत microbiota और मेजबान स्वास्थ्य पर उनके प्रभाव का अध्ययन प्रयोगशालाओं के लिए व्यावहारिक हैं के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण जरूरत है. अतः इन विट्रो (या पूर्व विवो) मल माइक्रोबायोटा संस्कृति प्रणाली का उपयोग ऐसे हस्तक्षेपों के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होगा11,12. विशेष रूप से, आंत microbiota विविधता और संरचना में आवधिक परिवर्तन के मामले में microbiota किण्वन क्षमता पर विभिन्न prebiotics के प्रभाव, मल पीएच, और SCFAs और लैक्टेट सहित माइक्रोबियल चयापचयों के स्तर का अध्ययन किया जा सकता है 13. इस में, माइक्रोबायोम न्यूनाधिक के एक उदाहरण के रूप में इनुलिन (सबसे व्यापक रूप से अध्ययन किए गए प्रीबायोटिक घटकों में से एक) का उपयोग करते हुए, इस सरल पूर्व विवो माइक्रोबायोटा बैच-कल्चर सिस्टम के चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का अनुमान लगाने के लिए इसका उपयोग प्रदर्शित करने के लिए वर्णित है माइक्रोबायोम न्यूनाधिक के साथ हस्तक्षेप के बाद मल माइक्रोबायोटा और माइक्रोबियल चयापचयों में परिवर्तन।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ प्रस्तुत इन विट्रो मल घोल किण्वन मॉडल मानव मल माइक्रोबायोटा की संरचना पर विभिन्न substrates और माइक्रोबियल उपभेदों (जैसे, prebiotics और प्रोबायोटिक्स) के प्रभाव का अनुमान लगाने के लिए एक सरल एकल बैच मॉडल है और ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों आभारी मधुमेह के लिए केंद्र से धन समर्थन स्वीकार करते हैं, मोटापा और चयापचय और नैदानिक और अनुवाद विज्ञान केंद्र, जागो वन चिकित्सा स्कूल, रक्षा धन विभाग (अनुदान संख्या: W81XWH-18-1-0118), हृदय चिकित्सा में Kermit ग्लेन फिलिप्स द्वितीय कुर्सी; स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों क्लाउड डी काली मिर्च पुराने अमेरिकियों केंद्र (P30AG12232 द्वारा वित्त पोषित); R01AG18915; R01DK114224 और नैदानिक और अनुवाद विज्ञान केंद्र (क्लिनिकल अनुसंधान इकाई, UL1TR001420 द्वारा वित्त पोषित), भी शुक्र है स्वीकार किया है. हम भी मल के नमूने प्रदान करने के लिए स्वयंसेवकों को धन्यवाद, और उनके तकनीकी के लिए हमारे अन्य प्रयोगशाला के सदस्यों को इस प्रयोग के दौरान मदद करता है.
Materials
| Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 217255 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | TGI | C2388 | Toxic |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Irritating |
| Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) | Acros organics | 2063450000 | Toxic, Irritating |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C121800 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| D-Pantothenic acid | Alfa Aesar | A16609 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) | Biorad | 1610729 | |
| DL-α-methylbutyrate | Sigma-Aldrich | W271918 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | F8263 | Toxic |
| Folic acid | Alfa Aesar | J62937 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
| Hepes | Alfa Aesar | A14777 | |
| Isobutyrate | Alfa Aesar | L04038 | |
| Isovalerate | Alfa Aesar | A18642 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Niacin (Nicotinic acid) | Sigma-Aldrich | N4126 | |
| Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) | Alfa Aesar | A14366 | Toxic |
| N-valerate | Sigma-Aldrich | 240370 | |
| P-aminobenzoic acid | MP China | 102569 | Toxic, Irritating |
| Phosphoric Acid (H3PO4) | Sigma-Aldrich | P5811 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
| Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1551128 | |
| Pyridoxine | Alfa Aesar | A12041 | |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Riboflavin | Alfa Aesar | A11764 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | 1613757 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher BioReagents | 7647-14-5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Chemicals | S320 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) | Acros organics | 206375000 | |
| Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) | Acros organics | 148991000 | |
| Trypticase | BD Biosciences | 211921 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| 0.22 µm membrane filter | |||
| AMPure magnetic purification beads | Agencourt | ||
| Anaerobic chamber with incubatore | Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA | ||
| Bottle filter | Corning | ||
| Cheesecloth | |||
| Illumina MiSeq sequencer | Miseq reagent kit v3 | ||
| pH meter | |||
| Qiagen PowerFecal kit | Qiagen | ||
| Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software | |||
| Qubit-3 fluorimeter | InVitrogen | ||
| Vortex | Thermoscientific | ||
| Waters-2695 Alliance HPLC system | Waters Corporation |
Referências
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