تقييم التعريب الخاص بنواه عدسه Zebrafish والنزاهة التكوينية
Summary
وقد تم تطوير هذه البروتوكولات لتحليل شكل العدسة القشرية ، والسلامة الهيكلية لغرز العدسة الزبرافيه في العدسات الثابتة والحية ، ولقياس وضعيه نواه العدسة الزبرافيه علي طول المحور الامامي الخلفي.
Abstract
و الزرد هو مناسبه فريدة من نوعها للتلاعب الوراثية والتصوير في الجسم الخارجي ، مما يجعلها نموذجا شعبيه متزايدة للدراسات الوراثية العكسية ولتوليد العابرة للتصوير في الجسم الخارجي. هذه القدرات فريدة من نوعها جعل الزرد منصة مثاليه لدراسة تطوير عدسه العين وعلم وظائف العيون. النتائج التي توصلنا اليها مؤخرا ان اكوابورين-0 ، Aqp0a ، مطلوب لاستقرار خياطه العدسة الاماميه ، وكذلك للتحول من نواه العدسة إلى مركز العدسة مع العمر ادي بنا إلى تطوير أدوات مناسبه بشكل خاص لتحليل خصائص العدسات الزرد. هنا نحن الخطوط العريضة طرق مفصله لتشريح العدسة التي يمكن تطبيقها علي كل من العدسات اليرقة والكبار ، لاعدادهم للتحليل النسيجي ، والمناعي والتصوير. ونحن نركز علي تحليل سلامه خياطه العدسة والمورفولوجية الخلية القشرية ومقارنه البيانات المتولدة من العدسات تشريح مع البيانات التي تم الحصول عليها من التصوير في الجسم المجري من الشكل العدسة التي جعلت ممكنا من قبل خط الزرد الوراثية الجديدة مع وراثيا ترميز الفلورسنت علامة. تحليل العدسات التي تم تشريحها عموديا علي محورها البصري يسمح بالتحديد الكمي للوضع النسبي لنواه العدسة علي طول المحور الامامي الخلفي. مطلوب حركه نواه العدسة من الوضع الامامي الاولي إلى المركز لبصريات العدسة العادية في zebrafish الكبار. التالي ، فان القياس الكمي للموقف النووي للعدسة يرتبط ارتباطا مباشرا بخواصه البصرية.
Introduction
و الزرد هو نموذج ممتاز لدراسة تطور العدسة وعلم وظائف العيون بسبب أوجه التشابه التشريحية لعدسات الثدييات, سهوله نسبيه للتلاعب الوراثي والدوائي, سرعه نمو العين الجنينية, حجم صغير والشفافية في المراحل المبكرة السماح للتصوير في الجسم الفيفو . وقد وضعت الأساليب الموصوفة هنا لتحليل الشكل عدسه الزرد في مراحل الجنينية والكبار مع التركيز علي السلامة التكوينية ، والمورفولوجية غشاء القشرية في المختبر والجسم المجري ، وموقع عدسه الموقف النووي علي طول المحور الامامي الخلفي السابق فيفو. هذه الأساليب بمثابه نقطه انطلاق للدراسات الوظيفية لتطوير العدسة وعلم وظائف القلب ، فضلا عن الشاشات الجينية العكسية لأنماط العدسات في zebrafish.
التصوير المورفولوجية عدسه الزرد
اكوابورين 0 (AQP0) هو البروتين الأكثر وفره في غشاء العدسة ، وهو ضروري لكل من تطوير العدسات والوضوح ، وذلك بسبب الوظائف الاساسيه المتعددة في الثدييات. Zebrafish لديها اثنين من Aqp0s (Aqp0a و Aqp0b) وقامنا بتطوير أساليب لتحليل فقدان وظائفهم في كل من العدسات الجنينية والبالغين. وتكشف دراساتنا ان aqp0a-/-المسوختتطور التعتيم القطبية الاماميه بسبب عدم استقرار الخياطة الاماميه ، و aqp0a/b المسوخ مزدوجة تطوير التعتيم النووي1. وقد ثبت AQP0 للعب ادوار في النقل المائي2، التصاق3،4، خلوي رسو5 وتوليد الانحدار مؤشر الانكسار6، ولكن تم اجراء هذه الدراسات إلى حد كبير في المختبر. يوفر الزرد فرصه فريدة لدراسة كيفيه فقدان وظيفة ، أو وظيفة مضطربة من Aqp0a أو Aqp0b سيؤثر علي التشكل ووظيفة في عدسه حيه. لتقييم شكل خليه العدسة والسلامة التكوينية اثناء التطوير ، قمنا بتعديل الأساليب الموجودة في المختبر مناعي7 للاستخدام في العدسات الجنينية والبالغة ، والمحولات المتولدة لمراقبه هذه العملية في الجسم المجري .
تم اجراء تحليل مناعي لهيكل غشاء البلازما والسلامة التكوينية في الاجنه الثابتة بالبالكامل والعدسات البالغة. عدسات zebrafish هي صغيره للغاية (قطر العدسة هو ~ 100 μm في الاجنه وتصل إلى 1 ملم في البالغين) مقارنه مع نظرائهم الثدييات ولها نقطه الغرز8، والتي يتم القبض عليها نادرا في الحلويات. التالي ، فان العدسات كلها ضرورية لتحليل السلامة التكوينية. لتحليل الجسم المجري لتشكيل الخياطة الاماميه ، وتصوير هندسه خلايا العدسات الدقيقة ، قمنا بتوليد المحولات عبر التعبير عن mapple التي وضعت علي وجه التحديد ملصقات لاغشيه العدسات.
مزايا التصوير الحي لغشاء العدسة المتحولة تشمل: 1) تجنب التحف التثبيت ، 2) دراسة التغيرات المورفولوجية الديناميكية في الأفلام الفاصلة الزمنيه ، و 3) تمكين الدراسات الطولية التي يمكن ان تكون مرتبطة الاحداث السابقة مع في وقت لاحق ظواهر. وعاده ما يمنع تصبغ القزحية التصوير الواضح لمحيط العدسة. أضافه 1-فينيل 2-ثيوريا (PTU) قبل المرحلة بريبريديا-5 (بريم-5)9 يمنع الخلايا الصباغية وتصبغ العين تصل إلى حوالي 4 أيام بعد الإخصاب (dpf). ومع ذلك ، بعد 4 dpf ، يتم حجب محيط العدسة في الجسم المجري، وخاصه في المراحل القديمة. وعلاوة علي ذلك ، فان كثافة العدسة نفسها تحجب التصوير من القطب الخلفي لها. ولذلك ، لدراسة المورفولوجية من محيط العدسة ، أو خياطه الخلفي ، بعد 4 dpf ، العدسات تحتاج إلى ان تكون مثيره وثابته.
وقد استخدمت خطوط الزرد المحورة وراثيا لتحليل بنيه غشاء العدسة الجنينية في الجسم المجري10. الQ01 المحورة وراثيا يعبر عن البروتين الفلوري السماوي تنصهر فيه تسلسل استهداف الغشاء ، Gap43 ، مدفوعا بمروج EF1α و HEXAMER من عنصر DF4 pax6 محسن بشكل مطلق في خلايا ألياف العدسة11. Q01 لديها التعبير خارج عدسي ، بما في ذلك الخلايا الاماكيني في شبكيه العين ، والذي يضيف اشاره الخلفية إذا كان الاهتمام الرئيسي هو العدسة. وضعنا خطا جديدا المحورة وراثيا الذي يعبر عن mApple غشاء المربوطة علي وجه التحديد في العدسة ، وذلك بهدف تجنب اي اشاره خارج عدسي.
توطين نواه العدسة
اكتشفنا ان نواه العدسة تتحرك من الموقع الامامي الاولي في اليرقات الزرد إلى موقع مركزي في المحور الامامي الخلفي في العدسات البالغين. ويعتقد ان هذا التحول في موقف نواه عدسه الانكسار عاليه لتكون شرطا للتطوير الطبيعي للبصريات عدسه الزرد1. تسمح أساليبنا بالقياس الكمي للمركزية النووية للعدسة فيما يتعلق بنصف قطر العدسة. باستخدام هذه الطريقة ، أظهرنا ان Aqp0a مطلوب للمركزية النووية للعدسة1، ويمكن تطبيق هذه الطريقة البسيطة علي دراسات أخرى لتطوير وفسيولوجيا العدسة وخصائصها البصرية في نموذج الزرد.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحليل شكل العدسة الزبرافيش هو الخطوة الاولي في فهم الأنماط الظاهرية في المسوخ ، أو اثار التدخلات الدوائية التي تهدف إلى دراسة علم الاحياء من عدسه العين. ونحن الخطوط العريضة لتحليل الغرز عدسه ، والنسيج الخلية ألياف القشرية وجوانب من نواه العدسة. وهذه النهج هي مزيج من المختبرات والكائ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود ان نعترف مصدر التمويل لدينا: المعاهد القومية للصحة R01 EY05661 إلى j. e. H ، Ines gehring للمساعدة في توليد aqp0a/b المسوخ مزدوجة وتربيه الزرد ، الدكتور دانيال dranow للمناقشات المؤدية إلى توليد العابرين ، الدكتور بروس مختبرات بلومبيرج والدكتور كين تشو لاستخدام المجاهر التشريح ، والدكتورة ميغان سميث للمساعدة في التحليل الإحصائي.
Materials
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | CAUTION – very toxic |
| 4% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 157-4 | CAUTION – health hazard, combustible |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | Objective and chamber temperature set to -21˚C |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | CAUTION – irritating to eyes and skin |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128 | CAUTION – combustible, penetrates skin |
| Disposable base mold | VWR Scientific | 15154-631 | |
| Disposable Pasteur glass pipets | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Dumont # 5 forceps | Dumont & Fils | Keep forceps sharpened | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | CAUTION – toxic |
| Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct | Addgene | ID:122451 | |
| ImageJ | Wayne Rasband, NIH | v1.51n | |
| Low Melt Agarose (LMA) | Apex | 902-36-6 | |
| NIS-Elements | Nikon | V 4.5 | |
| NIS-Elements AR software | Nikon | ||
| Olympus with a model 2.1.1.183 controller | Olympus Corp | DP70 | |
| Olympus microscope | Olympus Corp | SZX12 | |
| Phalloidin-Alexa Flour 546 | Thermo Fisher | A22283 | |
| Phenol Red indicator (1% w/v) | Ricca Chemical Company | 5725-16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399 | |
| Photoshop | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Photoshop software | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Plan Apo 60x/1.2 WD objective | Nikon | ||
| Power source | Wild Heerbrugg | MTr 22 | Or equivalent power source |
| Slide warmer model No. 26020FS | Fisher Scientific | 12-594 | |
| Sodium Hydroxide beads | Fisher Scientific | S612-3 | CAUTION – corrosive/irritating to eyes and skin, target organ – respiratory system, corrosive to metals |
| Superfrost/Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sylgard 184 silicone Dow Corning | World Prevision Instruments | SYLG184 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Triton X-100 BioXtra | Sigma | T9284 | CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive |
| Vannas micro-dissection scissors | Ted Pella Inc | 1346 | Sharp/sharp straight tips |
| Vectashield antifade mouting medium | Vector laboratories | H-1000 | |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 | Life Technologies | W11262 |
Referências
- Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
- Hall, J. E., Mathias, R. T. The Aquaporin Zero Puzzle. Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).
- Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0. Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).
- Kumari, S. S., Varadaraj, K. Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).
- Lindsey Rose, K. M., et al. The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).
- Kumari, S. S., Varadaraj, K. Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).
- Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).
- Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish. Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Greiling, T. M. S., Clark, J. I. Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis. Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).
- Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2002).
- Schilling, T. F., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. 261, 59-94 (2002).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish. Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).
- Soules, K., Link, B. Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye. BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).
- Greiling, T. M. S., Clark, J. I. The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).
- Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).
- Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics. Eye. 31, 68 (2016).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases. Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).
- Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. Zebrafish on the move towards ophthalmological research. Eye. 28 (4), 367-380 (2014).
- Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).
- Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).
- Gold, M. G., et al. AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency. EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).
- Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development. Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).
- Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency. Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).
- Hayes, J. M., et al. Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish. Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).
- Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish. Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).
- Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
