Beoordeling van zebravis lens Nucleus lokalisatie en Sutural integriteit
Summary
Deze protocollen werden ontwikkeld om de corticale lens morfologie, structurele integriteit van de zebravis lens hechtingen in vaste en live lenzen te analyseren en om de positie van de zebravis lens Nucleus te meten langs de voorste-posterior as.
Abstract
De zebravis is uniek geschikt voor genetische manipulatie en in vivo beeldvorming, waardoor het een steeds populairder model voor omgekeerde genetische studies en voor de productie van transgenes voor in vivo Imaging. Deze unieke mogelijkheden maken de zebravis een ideaal platform om oculaire lens ontwikkeling en fysiologie te bestuderen. Onze recente bevindingen dat een aquaporine-0, Aqp0a, is vereist voor de stabiliteit van de voorste lens hechting, evenals voor de verschuiving van de lenskern naar de lens centrum met de leeftijd leidde ons om tools te ontwikkelen vooral geschikt voor het analyseren van de eigenschappen van zebravis lenzen. Hier schetsen we gedetailleerde methoden voor lens dissectie die kunnen worden toegepast op zowel larvale en volwassen lenzen, om hen voor te bereiden op histologische analyse, Immunohistochemistry en imaging. We richten ons op de analyse van de lens hechting integriteit en corticale cel morfologie en vergelijk de gegevens gegenereerd uit ontleed lenzen met gegevens verkregen uit in vivo beeldvorming van de lens morfologie mogelijk gemaakt door een nieuwe transgene zebravis lijn met een genetisch gecodeerde fluorescerende marker. Analyse van ontleed lenzen loodrecht op hun optische as maakt kwantificering van de relatieve positie van de lenskern langs de voorste-posterior as. Beweging van de lenskern van een eerste voorste positie naar het centrum is vereist voor de normale lensoptiek in volwassen zebravis. Aldus, correleert een kwantitatieve maatregel van lenskern positie direct met zijn optische eigenschappen.
Introduction
De zebravis is een uitstekend model voor het bestuderen van lens ontwikkeling en fysiologie als gevolg van de anatomische gelijkenissen met zoogdieren lenzen, relatief gemak van genetische en farmacologische manipulatie, de snelheid van de embryonale ontwikkeling van het oog, kleine omvang en transparantie in een vroeg stadium waardoor in vivo beeldvorming. De hier beschreven methoden zijn ontwikkeld om zebravis lens morfologie te analyseren op embryonale en volwassen stadia met een focus op sutural integriteit, corticale membraan morfologie in vitro pt in vivo, en locatie van de lens nucleaire positie langs de anterior-posterior as ex vivo. Deze methoden dienen als uitgangspunt voor functionele studies van de lens ontwikkeling en fysiologie, evenals omgekeerde genetische schermen voor lens fenotypes in zebravis.
Imaging zebravis lens morfologie
Aquaporine 0 (AQP0) is de meest voorkomende lens membraan eiwit en is van cruciaal belang voor beide, lens ontwikkeling en duidelijkheid, als gevolg van meerdere essentiële functies bij zoogdieren. Zebravis hebben twee Aqp0s (Aqp0a en Aqp0b) en we hebben methoden ontwikkeld om het verlies van hun functies te analyseren in zowel embryonale en volwassen lenzen. Onze studies tonen aan dataqp0a-/-mutanten voorste polaire opaciteit te ontwikkelen als gevolg van instabiliteit van de voorste hechtdraad, en aqp0a/b dubbele mutanten ontwikkelen nucleaire opaciteit1. AQP0 is aangetoond rollen te spelen in het water transport2, adhesie3,4, cytoskelet verankering5 en generatie van de brekingsindex gradiënt6, maar deze studies zijn grotendeels uitgevoerd in vitro. De zebravis biedt een unieke gelegenheid om te bestuderen hoe het verlies van functie, of verstoord functie van Aqp0a of Aqp0b zou de morfologie en de functie van invloed zijn in een levende lens. Om te beoordelen lens cel morfologie en sutural integriteit tijdens de ontwikkeling, we gewijzigd bestaande in vitro immunohistochemische methoden7 voor gebruik in embryonale en volwassen lenzen, en gegenereerde transgenen om dit proces te controleren in vivo .
Immunohistochemische analyse van de plasmamembraan structuur en sutural integriteit werd uitgevoerd in hele vaste embryo’s en volwassen lenzen. Zebravis lenzen zijn extreem klein (lens diameter is ~ 100 µm in embryo’s en tot 1 mm bij volwassenen) in vergelijking met hun tegenhangers van zoogdieren en hebben punt hechtingen8, die zelden worden gevangen in cryosecties. Zo, hele lenzen zijn essentieel voor het analyseren van sutural integriteit. Voor in vivo analyse van de voorste hechting vorming, en de beeldvorming van precieze lens Cell architectuur, genereerden we transgenes uiten Mapple specifiek etikettering lens membranen.
Voordelen van Live Imaging van de lens membraan transgenes zijn: 1) het vermijden van fixatie artefacten, 2) het bestuderen van dynamische morfologische veranderingen in time-lapse films, en 3) het mogelijk maken longitudinale studies waarin eerdere gebeurtenissen kunnen worden gecorreleerd met later Fenotypen. Pigmentatie van de Iris voorkomt normaalgesproken duidelijke beeldvorming van de lens periferie. Toevoeging van 1-fenyl 2-thioureum (PTE) voor de Primordia-5 (Prim-5) fase9 voorkomt melanogenesis en oog pigmentatie tot ongeveer 4 dagen postfertilization (DPF). Echter, na 4 DPF, is de lens periferie verduisterd in vivo, met name in oudere stadia. Bovendien, de dichtheid van de lens zelf verduistert beeldvorming van de achterste paal. Daarom, om de morfologie van de lens periferie te bestuderen, of de achterste hechting, na 4 DPF, lenzen moeten worden versneden en vastgesteld.
Transgene zebravis lijnen zijn gebruikt om embryonale lens membraanstructuur te analyseren in vivo10. De Q01 transgene drukt een cyaan fluorescerende eiwit gesmolten tot een membraan targeting sequentie, Gap43, gedreven door de EF1α promotor en een hexamer van de DF4 Pax6 Enhancer element ubiquitously in lens Fiber cellen11. Q01 heeft extra-lensvormige uitdrukking, met inbegrip van amacrine cellen in het netvlies, die achtergrond signaal toevoegt als de primaire rente is de lens. We ontwikkelden een nieuwe transgene lijn die een membraan-tethered mApple specifiek in de lens uitdrukt, met als doel het vermijden van een extra-lensvormig signaal.
Lens Nucleus lokalisatie
We ontdekten dat de lens Nucleus verhuist van een eerste voorste locatie in larvale zebravis naar een centrale locatie in de voorste-posterior as in volwassen lenzen. Deze verschuiving in de positie van de hoge brekingsindex lens Nucleus wordt gedacht dat een eis voor de normale ontwikkeling van zebravis lens optica1. Onze methoden laten kwantificering van de lens nucleaire centralisatie in relatie tot de lens straal. Met behulp van deze methode, toonden we aan dat Aqp0a is vereist voor de lens nucleaire centralisatie1, en deze eenvoudige methode kan worden toegepast op andere studies van de ontwikkeling en fysiologie van de lens en de optische eigenschappen in de zebravis model.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analyse van de zebravis lens morfologie is de eerste stap in het begrijpen van fenotypen in mutanten, of de effecten van farmacologische interventies gericht op het bestuderen van de biologie van de oculaire lens. We schetsen methoden om lens hechtingen, corticale Fiber Cell morfologie en aspecten van de lens Nucleus te analyseren. Deze benaderingen zijn een combinatie van in vitro pt in vivo (vergeleken in tabel 1). De in vitro methoden zorgen voor meer detail van de buitenste…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag onze financiële bron te erkennen: NIH R01 EY05661 aan J. E. H, Ines Gehring voor het assisteren bij het genereren van de aqp0a/b dubbele mutanten en zebravis veeteelt, Dr Daniel Dranow voor discussies die leiden tot generatie van de transgenes, Dr Bruce Blumberg en Dr Ken Cho Labs voor het gebruik van hun ontleden microscopen, en Dr Megan Smith voor hulp bij statistische analyse.
Materials
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | CAUTION – very toxic |
| 4% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 157-4 | CAUTION – health hazard, combustible |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | Objective and chamber temperature set to -21˚C |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | CAUTION – irritating to eyes and skin |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128 | CAUTION – combustible, penetrates skin |
| Disposable base mold | VWR Scientific | 15154-631 | |
| Disposable Pasteur glass pipets | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Dumont # 5 forceps | Dumont & Fils | Keep forceps sharpened | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | CAUTION – toxic |
| Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct | Addgene | ID:122451 | |
| ImageJ | Wayne Rasband, NIH | v1.51n | |
| Low Melt Agarose (LMA) | Apex | 902-36-6 | |
| NIS-Elements | Nikon | V 4.5 | |
| NIS-Elements AR software | Nikon | ||
| Olympus with a model 2.1.1.183 controller | Olympus Corp | DP70 | |
| Olympus microscope | Olympus Corp | SZX12 | |
| Phalloidin-Alexa Flour 546 | Thermo Fisher | A22283 | |
| Phenol Red indicator (1% w/v) | Ricca Chemical Company | 5725-16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399 | |
| Photoshop | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Photoshop software | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Plan Apo 60x/1.2 WD objective | Nikon | ||
| Power source | Wild Heerbrugg | MTr 22 | Or equivalent power source |
| Slide warmer model No. 26020FS | Fisher Scientific | 12-594 | |
| Sodium Hydroxide beads | Fisher Scientific | S612-3 | CAUTION – corrosive/irritating to eyes and skin, target organ – respiratory system, corrosive to metals |
| Superfrost/Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sylgard 184 silicone Dow Corning | World Prevision Instruments | SYLG184 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Triton X-100 BioXtra | Sigma | T9284 | CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive |
| Vannas micro-dissection scissors | Ted Pella Inc | 1346 | Sharp/sharp straight tips |
| Vectashield antifade mouting medium | Vector laboratories | H-1000 | |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 | Life Technologies | W11262 |
Referências
- Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
- Hall, J. E., Mathias, R. T. The Aquaporin Zero Puzzle. Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).
- Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0. Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).
- Kumari, S. S., Varadaraj, K. Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).
- Lindsey Rose, K. M., et al. The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).
- Kumari, S. S., Varadaraj, K. Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).
- Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).
- Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish. Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Greiling, T. M. S., Clark, J. I. Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis. Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).
- Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2002).
- Schilling, T. F., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. 261, 59-94 (2002).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish. Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).
- Soules, K., Link, B. Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye. BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).
- Greiling, T. M. S., Clark, J. I. The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).
- Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).
- Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics. Eye. 31, 68 (2016).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases. Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).
- Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. Zebrafish on the move towards ophthalmological research. Eye. 28 (4), 367-380 (2014).
- Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).
- Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).
- Gold, M. G., et al. AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency. EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).
- Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development. Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).
- Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency. Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).
- Hayes, J. M., et al. Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish. Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).
- Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish. Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).
- Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
