Bewertung von Zebrafischen Lens Nukleus-Lokalisierung und Suturenintegrität

Summary

Diese Protokolle wurden entwickelt, um die Morphologie der kortikalen Linsen, die strukturelle Integrität der Nähte von Zebrafischen in festen und lebenden Linsen zu analysieren und die Position des Zebrafischlinsennkerns entlang der Anterior-nachträglichen Achse zu messen.

Abstract

Der Zebrafisch eignet sich eindeutig für die Genmanipulation und die In-vivo-Bildgebung und ist damit ein immer beliebter werdendes Modell für umgekehrte genetische Studien und für die Generierung von Transgenik für die In-vivo-Bildgebung. Diese einzigartigen Fähigkeiten machen den Zebrafisch zu einer idealen Plattform, um die Entwicklung und Physiologie der Augenlinsen zu untersuchen. Unsere jüngsten Erkenntnisse, dass ein Aquaporin-0, Aqp0a, für die Stabilität der vorderen Linsennaht sowie für die Verschiebung des Linsenkerns in das Linsenzentrum mit zunehmendem Alter erforderlich ist, haben uns dazu gebracht, Werkzeuge zu entwickeln, die besonders geeignet sind, die Eigenschaften von Zebrafischlinsen zu analysieren. Hier skizzieren wir detaillierte Methoden für die Linsenabtration, die sowohl auf Larven-als auch auf erwachsene Linsen angewendet werden können, um sie auf histologische Analysen, Immunhistochemie und Bildgebung vorzubereiten. Wir konzentrieren uns auf die Analyse der Linsen-Naht-Integrität und der kortikalen Zellmorphologie und vergleichen Daten, die aus zerschnittenen Linsen generiert werden, mit Daten, die aus der de vivo-Bildgebung gewonnenen Bildgebung der Linsenmorphologie gewonnen werden, die durch eine neuartige transgene Zebrafischlinie mit einer genetischen Kodiert fluoreszierenden Marker. Die Analyse von zersplitterten Linsen, die senkrecht zu ihrer optischen Achse stehen, ermöglicht eine Quantifizierung der relativen Position des Linsenkerns entlang der anterior-nachträglichen Achse. Die Bewegung des Linsenkerns von einer anfänglichen vorderen Position in die Mitte ist für die normale Linsenoptik bei erwachsenen Zebrafischen erforderlich. So korreliert eine quantitative Messung der nuklearen Position der Linse direkt mit ihren optischen Eigenschaften.

Introduction

Der Zebrafisch ist ein ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung der Linsenentwicklung und Physiologie aufgrund der anatomischen Ähnlichkeiten mit Säugetierlinsen, der relativen Leichtigkeit der genetischen und pharmakologischen Manipulation, der Geschwindigkeit der embryonalen Augenentwicklung, der geringen Größe und Transparenz. In der Anfangsphase , die es in vivo der Bildgebung erlaubt. Die hier beschriebenen Methoden wurden entwickelt, um die Morphologie der Zebrafischlinse in Embryonal-und Erwachsenenstadien zu analysieren, wobei der Schwerpunkt auf der heilsamen Integrität, der kortikalen Membranmorphologie in vitro und in vivoliegt, sowie die Lage der nuklearen Position der Linse entlang der Anterior-nachträgiere Achse ex vivo. Diese Methoden dienen als Ausgangspunkt für funktionelle Studien zur Linsenentwicklung und Physiologie sowie für umgekehrte genetische Bildschirme für Linsenphänotypen in Zebrafischen.

Bildgebung Zebrafisch-Linsenmorphologie

Aquaporin 0 (AQP0) ist das am häufigsten vorkommende Linsenmembranprotein und ist sowohl für die Entwicklung der Linsen als auch für die Klarheit der Linsen von entscheidender Bedeutung, da es bei Säugetieren viele wesentliche Funktionen gibt. Zebrafische haben zwei Aqp0s (Aqp0a und Aqp0b) und wir haben Methoden entwickelt, um den Verlust ihrer Funktionen sowohl in embryonalen als auch in erwachsenen Linsen zu analysieren. Unsere Studien zeigen, dass aqp0a^—-Mutanten aufgrund der Instabilität der vorderen Naht eine vordere polare Deckkraft entwickeln, und aqp0a/b Doppelmutanten die nukleare Deckkraft 1 entwickeln. AQP0 hat sich als eine Rolle im Wassertransport 2,^Haftung3,4, Zytoskelett-Verankerung 5 und Erzeugung des Brechungsindex Gradienten6, aber diese Studien wurden weitgehend inder vitro. Der Zebrafisch bietet eine einzigartige Gelegenheit, zu untersuchen, wie Funktionsverlust, oder gestörte Funktion von Aqp0a oder Aqp0b die Morphologie und Funktion in einer lebenden Linse beeinflussen würde. Um die Morphologie der Linsenzellen und die Integrität der Sutural während der Entwicklung zu beurteilen, haben wir die bestehenden In-vitro-immunhistochemischen Methoden 7 für den Einsatz in embryonalen und erwachsenen Linsen modifiziert und Transgenik erzeugt, um diesen Prozess in vivo zu überwachen. .

Die immunhistochemische Analyse der Plasma-Membranstruktur und der sutural integtären Struktur wurde in ganzen festen Embryonen und erwachsenen Linsen durchgeführt. Zebrafischlinsen sind extrem klein (der Linsendurchmesser beträgt ~ 100 μm bei Embryonen und bei Erwachsenen bis zu 1 mm) im Vergleich zu ihren Säugetier-Pendants und haben Punktzahl⁸, die in Kryoschnitten selten erfasst werden. Daher sind ganze Objektive für die Analyse der Integrität des uturalen. Denn in vivo-Analyse der vorderen Nahtbildung und Abbildung der präzisen Linsenzellen-Architektur haben wir Transgenik erzeugt, die mApple-spezifisch kennzeichnende Linsenmembranen ausdrückt.

Die Vorteile der Live-Bildgebung von Objektivmembrantransgenik sind: 1) Vermeidung von Fixierungsarten, 2) das Studium dynamischer morphologischer Veränderungen in Zeitraffer-Filmen und 3) die Möglichkeit länglicher Studien, in denen frühere Ereignisse mit späteren Phänotypen. Die Pigmentierung der Iris verhindert in der Regel eine klare Abbildung der Linsenperipherie. Die Zugabe von 1-Phenyl-2-Thiourea (PTU) vor der Primordia-5 (Prim-5) Stufe⁹ verhindert Melanogenese und Augenpigmentierung bis zu etwa 4 Tagen Postfertilisation (dpf). Nach 4 dpf wird die Linsenperipherie jedoch in vivoverdeckt, besonders in älteren Stadien. Darüber hinaus verdeckt die Dichte der Linse selbst die Abbildung des hinteren Pols. Um die Morphologie der Linsenperipherie oder der hinteren Naht nach 4 dpf zu studieren, müssen die Linsen daher exzessiv und fixiert werden.

Mit transgenen Zebrafischlinien wurden die embryonalen Linsenmembranstrukturen in vivo¹⁰analysiert. Das transgene Q01 drückt ein cyan fluoreszierendes Protein aus, das zu einer Membranzielsequenz, Gap43, verschmolzen ist, angetrieben vom EF1 α-Promoter und einem Hexamer des DF4 pax6-Enhancer-Elements, das in Linsenfaserzellen 11 allgegenwärtig ist. Q01 hat einen extra-Lentikelausdruck, einschließlich Amacrin-Zellen in der Netzhaut, was Hintergrundsignal hinzufügt, wenn das primäre Interesse die Linse ist. Wir haben eine neuartige transgene Linie entwickelt, die einen Membran-gebärten mApple speziell in der Linse ausdrückt, mit dem Ziel, jedes extra-linsenförmige Signal zu vermeiden.

Lens nucleus Lokalisierung

Wir entdeckten, dass sich der Linsenkern von einer anfänglichen vorderen Position in Larvenzebrafischen zu einem zentralen Ort in der anterior-nachträglichen Achse in erwachsenen Linsen bewegt. Diese Verschiebung der Position des hochbrechenden Indexlinsenkerns gilt als Voraussetzung für die normale Entwicklung der Zebrafischlinsen-Optik¹. Unsere Methoden ermöglichen die Quantifizierung der nuklearen Zentralisierung der Linse in Bezug auf den Linsenradius. Mit dieser Methode haben wir gezeigt, dass Aqp0a für die Atomzentralisierung¹benötigt wird, und diese einfache Methode kann auf andere Studien zur Entwicklung und Physiologie des Objektivs und seiner optischen Eigenschaften im Zebrafischmodell angewendet werden.

Protocol

Die in dieser Studie verwendeten Tierprotokolle halten sich an das ARVO-Statement für die Verwendung von Tieren in der Augen-und Sehforschung und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of California, Irvine, genehmigt. 1. Zebrafisch Husbandry und Euthanasie Zebrafische (AB-Stamm) unter normalen Laborbedingungen zu züchten und zu pflegen12. Embryonen im Embryomedium (EM) 12erhöhen. Fügen…

Representative Results

Erwachsene Zebrafische Augenanatomie ähneln der von Säugetieren (Abbildung 1A). Trotz einiger Unterschiede zwischen Zebrafischen und Säugetieren Augen, wie mit einer Ziliarzone statt mit einem Ziliarkörper 17,Unterschiede in den optischen Eigenschaften18, und Unterschiede in der Morphogenese während der Embryonalentwicklung 19, die Zebrafischauge ist ein ausgezeichnetes Modell für d…

Discussion

Die Analyse der Zebrafisch-Linsenmorphologie ist der erste Schritt, um Phenotypen bei Mutanten zu verstehen, oder die Auswirkungen pharmakologischer Eingriffe, die auf die Erforschung der Biologie der Augenlinse abzielen. Wir skizzieren Methoden zur Analyse von Linsennähten, kortikalen Faserzellmorphologie und Aspekten des Linsenkerns. Diese Ansätze sind eine Kombination von in vitro und in vivo (im Vergleich in Tabelle 1). Die In-vitro-Methoden ermöglichen eine größere De…

Materials

1-phenyl-2-thiourea (PTU)	Sigma	P7629	CAUTION – very toxic
4% Paraformaldehyde aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	RT 157-4	CAUTION – health hazard, combustible
Confocal microscope	Nikon	Eclipse Ti-E
Cryostat	Leica	CM3050S	Objective and chamber temperature set to -21˚C
DAPI	Invitrogen	D1306	CAUTION – irritating to eyes and skin
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D128	CAUTION – combustible, penetrates skin
Disposable base mold	VWR Scientific	15154-631
Disposable Pasteur glass pipets	Fisherbrand	13-678-20A
Dumont # 5 forceps	Dumont & Fils		Keep forceps sharpened
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040	CAUTION – toxic
Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Glycerol	Sigma	G2025
huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct	Addgene	ID:122451
ImageJ	Wayne Rasband, NIH	v1.51n
Low Melt Agarose (LMA)	Apex	902-36-6
NIS-Elements	Nikon	V 4.5
NIS-Elements AR software	Nikon
Olympus  with a model 2.1.1.183 controller	Olympus Corp	DP70
Olympus microscope	Olympus Corp	SZX12
Phalloidin-Alexa Flour 546	Thermo Fisher	A22283
Phenol Red indicator (1% w/v)	Ricca Chemical Company	5725-16
Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP399
Photoshop	Adobe	CS5 v12.0
Photoshop software	Adobe	CS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD objective	Nikon
Power source	Wild Heerbrugg	MTr 22	Or equivalent power source
Slide warmer model No. 26020FS	Fisher Scientific	12-594
Sodium Hydroxide beads	Fisher Scientific	S612-3	CAUTION – corrosive/irritating to eyes and skin, target organ – respiratory system, corrosive to metals
Superfrost/Plus microscope slide	Fisher Scientific	12-550-15
Sylgard 184 silicone Dow Corning	World Prevision Instruments	SYLG184
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583
Triton X-100 BioXtra	Sigma	T9284	CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive
Vannas micro-dissection scissors	Ted Pella Inc	1346	Sharp/sharp straight tips
Vectashield antifade mouting medium	Vector laboratories	H-1000
Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594	Life Technologies	W11262