Vurdering av sebrafisk Lens nucleus lokalisering og Sutural integritet

Summary

Disse protokollene ble utviklet for å analysere kortikale linse morfologi, strukturelle integriteten til sebrafisk linsen sting i faste og levende linser og for å måle plasseringen av sebrafisk linsen kjernen langs fremre-bakre akse.

Abstract

Sebrafisk er unikt egnet for genetisk manipulering og in vivo Imaging, noe som gjør den til en stadig mer populær modell for omvendte genetiske studier og for generering av transgenics for in vivo Imaging. Disse unike evnene gjør sebrafisk til en ideell plattform for utvikling og fysiologi av øyelinsen. Våre nylige funn at en Aquaporin-0, Aqp0a, er nødvendig for stabilitet av fremre linse Sutur, samt for forskyvning av linsen kjernen til linsen sentrum med alderen førte oss til å utvikle verktøy spesielt egnet til å analysere egenskapene til sebrafisk linser. Her har vi skissere detaljerte metoder for linse disseksjon som kan brukes til både larvestadiet og voksen linser, for å forberede dem for histologiske analyse, immunhistokjemi og Imaging. Vi fokuserer på analyse av objektiv Sutur integritet og kortikale celle morfologi og sammenligner data generert fra dissekert linser med data innhentet fra in vivo Imaging av linse morfologi gjort mulig av en roman transgene sebrafisk linje med en genetisk kodet fluorescerende markør. Analyse av dissekert linser vinkelrett på deres optiske aksen tillater kvantifisering av den relative plasseringen av linsen kjernen langs fremre-bakre akse. Bevegelse av linsen kjernen fra en første fremre posisjon til sentrum er nødvendig for normal linseoptikk i voksen sebrafisk. Således, en kvantitativ mål av linsen atomer holdning direkte samsvarer med dens optisk eiendom.

Introduction

Den sebrafisk er en utmerket modell for å studere linsen utvikling og fysiologi på grunn av anatomiske likheter til pattedyr linser, relativ enkel genetisk og farmakologisk manipulasjon, hastighet av embryonale øyet utvikling, liten størrelse og åpenhet på tidlige stadier, noe som åpner for in vivo Imaging. Metodene som er beskrevet her ble utviklet for å analysere sebrafisk linse morfologi på embryonale og voksne stadier med fokus på sutural integritet, kortikale membran morfologi in vitro og in vivo, og plassering av linsen kjernefysiske posisjon langs fremre-bakre akse ex vivo. Disse metodene fungerer som et utgangspunkt for funksjonelle studier av linse utvikling og fysiologi, samt omvendt genetiske skjermer for objektiv fenotyper i sebrafisk.

Imaging sebrafisk linse morfologi

Aquaporin 0 (AQP0) er den mest tallrike linse membran protein og er avgjørende for både objektiv utvikling og klarhet, på grunn av flere viktige funksjoner i pattedyr. Sebrafisk har to Aqp0s (Aqp0a og Aqp0b) og vi har utviklet metoder for å analysere tap av sine funksjoner i både embryonale og voksne linser. Våre studier viser at aqp0a^-/-mutanter utvikler fremre Polar dekkevne på grunn av ustabilitet i fremre Sutur, og aqp0a/b dobbel mutanter utvikle kjernefysisk gjennomsiktighet¹. AQP0 har vist å spille roller i vann transport², vedheft^3,4, cytoskjelettkomponenter forankring⁵ og generering av brytningsindeksen gradient⁶, men disse studiene har i stor grad blitt utført i for å Sebrafisk gir en unik mulighet til å studere hvordan tap av funksjon, eller perturbed funksjon av Aqp0a eller Aqp0b vil påvirke morfologi og funksjon i en levende linse. For å vurdere objektiv celle morfologi og sutural integritet under utvikling, endret vi eksisterende in vitro immunhistokjemiske metoder⁷ for bruk i embryonale og voksne linser, og genererte transgenics for å overvåke denne prosessen in vivo .

Immunhistokjemiske analyse av plasma membran struktur og sutural integritet ble utført i hele faste embryo og voksen linser. Sebrafisk linser er svært små (linse diameter er ~ 100 μm i embryo og opp til 1 mm i voksne) sammenlignet med sine pattedyr kolleger og har punkt sting⁸, som sjelden fanges i cryosections. Dermed hele linser er avgjørende for å analysere sutural integritet. For in vivo analyse av fremre Sutur formasjon, og bilde av presis linse celle arkitektur, genererte vi Transgenics uttrykke mApple spesielt merking linse membraner.

Fordeler med live Imaging av linse membran transgenics inkluderer: 1) unngå fiksering gjenstander, 2) studere dynamiske morfologiske endringer i time-lapse filmer, og 3) muliggjør langsgående studier der tidligere hendelser kan være korrelert med senere fenotyper. Pigmentering av Iris hindrer normalt klar bilde av linsen periferi. Tillegg av 1-fenyl 2-thiourea (PTU) før Primordia-5 (prim-5) trinn⁹ forhindrer melanogenese og øye pigmentering opptil rundt 4 dager postfertilization (DPF). Men etter 4 DPF, linsen periferien er skjult i vivo, spesielt på eldre stadier. Videre tettheten av linsen selv tilslører bilde av sin bakre pol. Derfor, for å studere morfologi av linsen periferi, eller bakre Sutur, etter 4 DPF, linser må excised og fast.

Transgene sebrafisk-linjer har blitt brukt til å analysere embryonale linse membran strukturen i vivo¹⁰. Q01 transgene uttrykker en cyan fluorescerende protein smeltet til en membran rettet sekvens, Gap43, drevet av EF1α promoter og en heksamer av DF4 pax6 Enhancer element overalt i linse fiber celler¹¹. Q01 har ekstra linse uttrykk, inkludert amacrine celler i Retina, som legger til bakgrunns signal hvis den primære interessen er objektivet. Vi utviklet en roman transgene line som uttrykker en membran-bundet mApple spesielt i objektivet, med sikte på å unngå eventuelle ekstra linse signal.

Lokalisering av linse kjerne

Vi oppdaget at linsen kjernen beveger seg fra en første fremre plassering i larvestadiet sebrafisk til et sentralt sted i fremre-bakre aksen i voksen linser. Dette skiftet i plasseringen av høy brytningsindeks linsen kjernen antas å være et krav for normal utvikling av sebrafisk linseoptikk¹. Våre metoder tillater kvantifisering av objektiv kjernefysisk sentralisering i forhold til linsen radius. Ved hjelp av denne metoden, viste vi at Aqp0a er nødvendig for objektiv kjernefysisk sentralisering¹, og denne enkle metoden kan brukes til andre studier av utvikling og fysiologi av linsen og dens optiske egenskaper i sebrafisk modellen.

Protocol

Dyret protokollene som brukes i denne studien holder seg til ARVO statement for bruk av dyr i øye og Vision forskning og har blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av University of California, Irvine. 1. sebrafisk og døds- Heve og vedlikeholde sebrafisk (AB-belastning) under standard laboratorieforhold12. Raise embryo i embryo medium (EM)12. Legg 0,003% PTU til EM fra 20-24 h postfertilization (…

Representative Results

Voksen sebrafisk øye anatomi ligner det av pattedyr (figur 1a). Til tross for noen forskjeller mellom sebrafisk og pattedyr øyne, slik som å ha en ciliary sone i stedet for en ciliary kropp17, forskjeller i optiske egenskaper18, og forskjeller i morphogenesis under embryonale utviklingen19, den sebrafisk Eye er en utmerket modell for å studere øye utvikling og forstå øyensykdom<sup…

Discussion

Analyse av sebrafisk linse morfologi er det første skrittet for å forstå fenotyper i mutanter, eller virkningene av farmakologiske intervensjoner som tar sikte på å studere biologi av øyelinsen. Vi skisserer metoder for å analysere linse sting, kortikale fiber celle morfologi og aspekter av linsen kjernen. Disse tilnærmingene er en kombinasjon av in vitro og in vivo (sammenlignet i tabell 1). In vitro metoder gir større detalj av den ytre kortikale celle morfologi, sam…

Materials

1-phenyl-2-thiourea (PTU)	Sigma	P7629	CAUTION – very toxic
4% Paraformaldehyde aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	RT 157-4	CAUTION – health hazard, combustible
Confocal microscope	Nikon	Eclipse Ti-E
Cryostat	Leica	CM3050S	Objective and chamber temperature set to -21˚C
DAPI	Invitrogen	D1306	CAUTION – irritating to eyes and skin
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D128	CAUTION – combustible, penetrates skin
Disposable base mold	VWR Scientific	15154-631
Disposable Pasteur glass pipets	Fisherbrand	13-678-20A
Dumont # 5 forceps	Dumont & Fils		Keep forceps sharpened
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040	CAUTION – toxic
Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Glycerol	Sigma	G2025
huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct	Addgene	ID:122451
ImageJ	Wayne Rasband, NIH	v1.51n
Low Melt Agarose (LMA)	Apex	902-36-6
NIS-Elements	Nikon	V 4.5
NIS-Elements AR software	Nikon
Olympus  with a model 2.1.1.183 controller	Olympus Corp	DP70
Olympus microscope	Olympus Corp	SZX12
Phalloidin-Alexa Flour 546	Thermo Fisher	A22283
Phenol Red indicator (1% w/v)	Ricca Chemical Company	5725-16
Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP399
Photoshop	Adobe	CS5 v12.0
Photoshop software	Adobe	CS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD objective	Nikon
Power source	Wild Heerbrugg	MTr 22	Or equivalent power source
Slide warmer model No. 26020FS	Fisher Scientific	12-594
Sodium Hydroxide beads	Fisher Scientific	S612-3	CAUTION – corrosive/irritating to eyes and skin, target organ – respiratory system, corrosive to metals
Superfrost/Plus microscope slide	Fisher Scientific	12-550-15
Sylgard 184 silicone Dow Corning	World Prevision Instruments	SYLG184
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583
Triton X-100 BioXtra	Sigma	T9284	CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive
Vannas micro-dissection scissors	Ted Pella Inc	1346	Sharp/sharp straight tips
Vectashield antifade mouting medium	Vector laboratories	H-1000
Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594	Life Technologies	W11262