Evaluación de la localización del núcleo de la lente de pez zebrafish y integridad sutural
Summary
Estos protocolos se desarrollaron para analizar la morfología de las lentes corticales, la integridad estructural de las lentes de pez cebra en lentes fijas y vivas y para medir la posición del núcleo de la lente de pez cebra a lo largo del eje anterior-posterior.
Abstract
El pez cebra es especialmente adecuado para la manipulación genética y la imagen in vivo , convirtiéndolo en un modelo cada vez más popular para estudios genéticos inversos y para la generación de transgénicos para imágenes in vivo . Estas capacidades únicas hacen que el pez cebra sea una plataforma ideal para estudiar el desarrollo de lentes oculares y la fisiología. Nuestros hallazgos recientes que un Aquaporin-0, Aqp0a, es necesario para la estabilidad de la sutura de la lente anterior, así como para el cambio del núcleo de la lente al centro de la lente con la edad nos llevó a desarrollar herramientas especialmente adecuadas para el análisis de las propiedades de las lentes de pez cebra. Aquí describimos métodos detallados para la disección de lentes que se pueden aplicar tanto a las lentes larvaria como a las adultas, para prepararlas para el análisis histológico, la inmunohistoquímica y las imágenes. Nos centramos en el análisis de la integridad de la sutura de la lente y la morfología de las células corticales y comparamos los datos generados a partir de lentes diseccionadas con datos obtenidos de imágenes in vivo de morfología de lentes hechas posibles por una novela línea de pez cebra transgénica con un marcador fluorescente codificado. El análisis de las lentes diseccionadas perpendiculares a su eje óptico permite cuantificar la posición relativa del núcleo del objetivo a lo largo del eje anterior-posterior. Se requiere el movimiento del núcleo de la lente desde una posición anterior inicial hasta el centro para la óptica de lente normal en el pez cebra adulto. Por lo tanto, una medida cuantitativa de la posición nuclear de la lente se correlaciona directamente con sus propiedades ópticas.
Introduction
El pez cebra es un excelente modelo para el estudio del desarrollo de lentes y la fisiología debido a las similitudes anatómicas con las lentes de mamíferos, la relativa facilidad de manipulación genética y farmacológica, la velocidad del desarrollo embrionario de los ojos, el tamaño pequeño y la transparencia en etapas tempranas que permiten la creación de imágenes in vivo . Los métodos descritos aquí se desarrollaron para analizar la morfología de las lentes de pez cebra en etapas embrionarias y adultas con un enfoque en la integridad sutural, la morfología de la membrana cortical in vitro e in vivo, y la ubicación de la posición nuclear de la lente a lo largo del eje anterior-posterior ex vivo. Estos métodos sirven como punto de partida para estudios funcionales de desarrollo de lentes y fisiología, así como pantallas genéticas inversas para fenotipos de lentes en pez cebra.
Morfología de lente de pez cebra de imagen
Aquaporin 0 (AQP0) es la proteína de membrana de lente más abundante y es fundamental para el desarrollo de lentes y la claridad, debido a múltiples funciones esenciales en los mamíferos. El pez cebra tiene dos Aqp0s (Aqp0a y Aqp0b) y hemos desarrollado métodos para analizar la pérdida de sus funciones tanto en lentes embrionarias como adultas. Nuestros estudios revelan que aqp0a-/-los mutantes desarrollan opacidad polar anterior debido a la inestabilidad de la sutura anterior, y los mutantes dobles aqp0a/b desarrollan opacidad nuclear1. Se ha demostrado que AQP0 juega papeles en el transporte de agua2, la adherencia3,4, el anclaje citoesquelético5 y la generación del índice de refracción gradiente6, pero estos estudios se han realizado en gran parte en Vitro. El pez cebra proporciona una oportunidad única para estudiar cómo la pérdida de la función, o la función perturbada de Aqp0a o Aqp0b afectaría la morfología y la función en un lente vivo. Para evaluar la morfología de las células de los lentes y la integridad sutural durante el desarrollo, modificamos los métodos inmunohistoquímicos in vitro existentes7 para su uso en lentes embrionarias y adultas, y generamos transgénicos para monitorear este proceso in vivo .
El análisis inmunohistoquímico de la estructura de la membrana plasmática y la integridad sutural se realizó en embriones fijos enteros y lentes para adultos. Las lentes de pez cebra son extremadamente pequeñas (el diámetro de la lente es de ~ 100 μm en embriones y hasta 1 mm en adultos) en comparación con sus homólogos de mamíferos y tienen suturas puntuales8, que se capturan con poca frecuencia en las criáreas. Por lo tanto, las lentes enteras son esenciales para analizar la integridad sutural. Para el análisis in vivo de la formación de sutura anterior, y la creación de imágenes de la arquitectura precisa de células de lentes, generamos transgénicos expresando Mapple específicamente las membranas de los lentes.
Las ventajas de la imagen en vivo de transgénicos de membrana de lente incluyen: 1) evitar artefactos de fijación, 2) estudiar cambios morfológicos dinámicos en películas de lapso de tiempo, y 3) permitir estudios longitudinales en los que los eventos anteriores pueden correlacionarse con más adelante Fenotipos. La pigmentación del iris normalmente previene imágenes claras de la periferia de la lente. La adición de 1-fenil 2-tiourea (PTU) antes de la fase9 de primordia-5 (Prim-5) previene la melanogénesis y la pigmentación ocular hasta alrededor de 4 días de postfertilización (DPF). Sin embargo, después de 4 DPF, la periferia de la lente está oscurecida in vivo, particularmente en las etapas más antiguas. Además, la densidad de la lente en sí oscurece la imagen de su polo posterior. Por lo tanto, para estudiar la morfología de la periferia de la lente, o la sutura posterior, después de 4 DPF, las lentes deben ser extirpado y fijas.
Se han utilizado líneas de pez pez cebra transgénicos para analizar la estructura de la membrana de la lente embrionaria in vivo10. El Q01 transgénico expresa una proteína fluorescente cian fusionada a una secuencia de objetivo de membrana, Gap43, impulsada por el promotor EF1α y un hexámero del elemento DF4 PAX6 Enhancer ubiadamente en las células de fibra de lente11. El Q01 tiene una expresión extra-lenticular, incluyendo células amacrinas en la retina, que añade señal de fondo si el interés principal es la lente. Desarrollamos una novedosa línea transgénica que expresa un mApple de membrana atada específicamente en la lente, con el objetivo de evitar cualquier señal extra-lenticular.
Localización del núcleo de la lente
Descubrimos que el núcleo de la lente se mueve desde una ubicación anterior inicial en el pez cebra de la larval hasta una ubicación central en el eje anterior-posterior en lentes adultas. Este cambio en la posición del núcleo del objetivo de alto índice de refracción se cree que es un requisito para el desarrollo normal de la óptica de la lente de pez cebra1. Nuestros métodos permiten la cuantificación de la centralización nuclear de la lente en relación con el radio de la lente. Usando este método, mostramos que Aqp0a es necesario para la centralización nuclear de la lente1, y este método simple se puede aplicar a otros estudios del desarrollo y la fisiología de la lente y sus propiedades ópticas en el modelo de pez cebra.
Protocol
Representative Results
Discussion
El análisis de la morfología de las lentes de pez cebra es el paso inicial en la comprensión de los fenotipos en los mutantes, o los efectos de las intervenciones farmacológicas destinadas a estudiar la biología de la lente ocular. Describimos métodos para analizar suturas de lentes, morfología de células de fibra cortical y aspectos del núcleo de la lente. Estos enfoques son una combinación de in vitro e in vivo (comparado en el cuadro 1). Los métodos in vitro permi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría reconocer nuestra fuente de financiación: NIH r01 EY05661 a j. e. h., Inés Gehring para ayudar con la generación de los aqp0a/b dobles mutantes y la cría de pez cebra, el Dr. Daniel Dranow para las discusiones que conducen a la generación de la transgénica, Dr. Bruce Los laboratorios de Blumberg y Ken cho para el uso de sus microscopios de disección, y la Dra. Megan Smith para obtener ayuda con el análisis estadístico.
Materials
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | CAUTION – very toxic |
| 4% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 157-4 | CAUTION – health hazard, combustible |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | Objective and chamber temperature set to -21˚C |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | CAUTION – irritating to eyes and skin |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128 | CAUTION – combustible, penetrates skin |
| Disposable base mold | VWR Scientific | 15154-631 | |
| Disposable Pasteur glass pipets | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Dumont # 5 forceps | Dumont & Fils | Keep forceps sharpened | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | CAUTION – toxic |
| Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct | Addgene | ID:122451 | |
| ImageJ | Wayne Rasband, NIH | v1.51n | |
| Low Melt Agarose (LMA) | Apex | 902-36-6 | |
| NIS-Elements | Nikon | V 4.5 | |
| NIS-Elements AR software | Nikon | ||
| Olympus with a model 2.1.1.183 controller | Olympus Corp | DP70 | |
| Olympus microscope | Olympus Corp | SZX12 | |
| Phalloidin-Alexa Flour 546 | Thermo Fisher | A22283 | |
| Phenol Red indicator (1% w/v) | Ricca Chemical Company | 5725-16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399 | |
| Photoshop | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Photoshop software | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Plan Apo 60x/1.2 WD objective | Nikon | ||
| Power source | Wild Heerbrugg | MTr 22 | Or equivalent power source |
| Slide warmer model No. 26020FS | Fisher Scientific | 12-594 | |
| Sodium Hydroxide beads | Fisher Scientific | S612-3 | CAUTION – corrosive/irritating to eyes and skin, target organ – respiratory system, corrosive to metals |
| Superfrost/Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sylgard 184 silicone Dow Corning | World Prevision Instruments | SYLG184 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Triton X-100 BioXtra | Sigma | T9284 | CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive |
| Vannas micro-dissection scissors | Ted Pella Inc | 1346 | Sharp/sharp straight tips |
| Vectashield antifade mouting medium | Vector laboratories | H-1000 | |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 | Life Technologies | W11262 |
Referências
- Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
- Hall, J. E., Mathias, R. T. The Aquaporin Zero Puzzle. Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).
- Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0. Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).
- Kumari, S. S., Varadaraj, K. Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).
- Lindsey Rose, K. M., et al. The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).
- Kumari, S. S., Varadaraj, K. Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).
- Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).
- Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish. Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Greiling, T. M. S., Clark, J. I. Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis. Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).
- Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2002).
- Schilling, T. F., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. 261, 59-94 (2002).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish. Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).
- Soules, K., Link, B. Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye. BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).
- Greiling, T. M. S., Clark, J. I. The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).
- Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).
- Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics. Eye. 31, 68 (2016).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases. Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).
- Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. Zebrafish on the move towards ophthalmological research. Eye. 28 (4), 367-380 (2014).
- Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).
- Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).
- Gold, M. G., et al. AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency. EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).
- Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development. Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).
- Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency. Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).
- Hayes, J. M., et al. Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish. Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).
- Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish. Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).
- Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
