ひと臍帯血由来 cd34 陽性造血幹細胞の体外増幅+細胞を用いたバルプロ酸
Summary
ここで、ex は説明 cd34 陽性から造血幹細胞の体外増幅+臍帯血由来の細胞は、サイトカイン カクテルとバルプロ酸の併用治療します。このメソッドは、いずれかのプリミティブの HSCs の体外増幅のかなりの程度につながる臨床または実験室。
Abstract
臍帯血 (UCB) 単位は、同種骨髄移植が必要な患者のひと造血幹細胞 (造血) の代替ソースを提供します。UCB では、いくつかのユニークな利点がありますが、UCB の各ユニット内の HSCs の限られた数は、再生医療での使用と大人で HSC 移植を制限します。Ex vivo CD34 の培養により機能人間 HSCs の効率的な拡張を可能+細胞 Ucb から分離と脱アセチル化酵素阻害剤、バルプロ酸 (VPA) と扱われる。ここで詳細なプロトコルを記述する培養条件および CD34 を急速に分離の方法論+細胞し、プリミティブの HSCs のプールの高度に拡張します。拡張の HSCs は短期および長期生着を確立することができる、すべての種類の分化した造血細胞に上昇を与えることができます。このメソッドは、自家 HSC 遺伝子治療の臨床応用の可能性を保持しても、遺伝子の編集に関連付けられた機能の HSCs の損失を克服するために魅力的なアプローチを提供します。
Introduction
臍帯血から造血幹細胞 (造血) の体外増幅 (UCB) 単位は再生医療や移植療法の HSC のアプリケーションのための大きい約束を保持します。UCB ユニットで移植が簡単なコレクション、高可用性、感染リスクを最小限、病気再発のリスクが低い、移植片対宿主病 (GVHD) の低周波などいくつかのユニークな利点。しかし、臨床現場での使用の主要な欠点は HSCs 各 UCB ユニット1内の限られた数です。移植片拒絶反応や異常免疫再構築のリスク、造血回復遅延生着 HSCs 結果の不十分な数。
現在、様々 な方法と戦略は、前のヴィヴォ Ucb の HSCs の限られた数を拡大する開発されています。低分子や化合物の生体内培養 ex と異なるサイトカイン カクテルの組み合わせが様々 な角度で HSC 番号2,3,4,5,6、拡張の結果します。 7,8。重要なは、ex vivo 文化条件は急速な細胞増殖、代謝活動の増加、プライマリ HSCs を定義するプリミティブの特性の損失につながるストレスを誘発します。したがって、プライマリ原始造血に近い特性を持つ機能の HSCs の偉大な数の拡大につながる発展途上のプロトコルが必要です。
CD34 の無血清培養+細胞および Ucb から分離されたプリミティブ HSCs4,9,10の多数の拡張のバルプロ酸 (VPA) 結果で治療します。Ucb から派生した既存の HSCs の増殖のためにもっぱらは HSC 拡大しません。代わりに、この拡張は、細胞の分裂と増殖9.の限られた数と組み合わせて原始的な表現型の取得により、します。サイトカインとバルプロ酸、CD34 の組み合わせと孵化の初期の 24-48 時間以内+細胞トランスクリプトームと長期的な造血を特徴づける形質のプロファイルを取得します。HSCs のパーセントの大幅な増加は HSCs (バルプロ酸治療の 24 時間以内の 63 倍)9数のプロンプトの増加を伴います。特に、バルプロ酸 ex vivo 拡大戦略は、低代謝活動で、原始的な特徴をさらに強調する HSCs を展開します。
ここで説明したメソッドを提供条件といずれかのプリミティブの HSCs の体外増幅のかなりの程度まで導く治療臨床または実験室。バルプロ酸治療と組み合わせたサイトカイン カクテル ex vivo 拡大戦略を使用します。バルプロ酸は、双極性障害と他の神経疾患の治療のための FDA の承認薬です。バルプロ酸と HSC 拡大はプロンプトと操作の時間および汚染のリスクを最小限に抑え、7 日以内に発生します。重要なは、このプロトコルは、長期的な HSC 表現型マーカー CD90 など CD49f バルプロ酸9による治療の後 24-48 時間以内の取得できます。このプロトコルで作成された拡張の HSC 移植すべて造血細胞系統に分化し、次 myeloablated NSG マウスへの移植長期生着を確立できるので、造血系を再生成する能力があります。モデル4。また、このプロトコルは再現性の高い、現実的な CD34 を効率的で迅速な分離できます+細胞 Ucb、この手順の工業化のために重大であります。
Ex vivo 拡張プロトコル バルプロ酸も遺伝子11を編集中に発生する HSCs の大幅な損失を克服するために可能性があります。遺伝子編集サイクリング細胞および DNA 修復機構の活性化に必要なサイトカインへの露出が必要です。バルプロ酸治療のプロンプトの効果により、このメソッドはに関連して現在期間内遺伝子組み換え細胞数が高い世代は、遺伝子の修正のプロトコルを利用するため有益にかもしれない。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで、急速にかなりの程度まで Ucb から機能人間 HSCs の数を拡大するためのプロトコルを提案する.このプロトコルを使用してパイロットと速度論的研究が示す、前のヴィヴォ拡張セルは速やかに獲得・ CD90 プリミティブ HSC 代謝特性9などいくつかの HSC 形質マーカーの発現を維持します。
この ex vivo 拡張プロトコルは比較的単純で信頼性の高いです。…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NYSTEM によって支えられた相対湿度に C030136 を付与彼のフィードバックと原稿の改正バーテック ジャブロン スキーに感謝したいと思います
Materials
| Expansion Media | Sigma-Aldrich | Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML | |
| AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. | Nexcelom | CS2-0106-25mL | |
| APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 | BD BIOSCIENCE | 555824 | |
| APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 | BD BIOSCIENCE | 555751 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| BD Falcon 15 ml Tube | BD Biosciences | 352097 | |
| BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352063 | |
| BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Bovine serum albumine solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-046-703 | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cell analyzer and sorter | BD Biosciences | FACS Aria II | |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter | |
| Cell separator device | autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec | ||
| Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-PD100-002 | |
| Density gradient media | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | |
| FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 | BIOLEGEND | 328108 | |
| FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | BIOLEGEND | 400109 | |
| Inverted microscope | |||
| PBS | Corning cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 308FKN | |
| Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) | R&D Systems | 203-IL | |
| Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC | |
| Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) | R&D Systems | 288-TP | |
| Total Antibody Compensation Bead Kit | thermofisher | A10497 | |
| Umbilical Cord-blood | Placental Blood Program at the New York Blood Center | http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/ | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | P4543 |
References
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