هنا ، نقدم نهج التوافقية باستخدام المجهر عاليه الدقة ، والاداات الحسابية ، ووضع العلامات خليه واحده في الاجنه c. ايليجنس المعيشة لفهم ديناميات خليه واحده اثناء النمو العصبي.
كاجورهابديستيس ايلينتس (C. اليجايليس) تبرز باعتبارها الكائن الوحيد الذي يمكن ملاحظه التحدي المتمثل في فهم الأصول الخلوية للجهاز العصبي بأكمله ، مع دقه خليه واحده ، في الجسم الحي. هنا ، ونحن نقدم بروتوكول متكامل لفحص النمو العصبي في الاجنه c. اليجس . يجمع بروتوكولنا بين التصوير والتتبع والتعقب التشريحي العصبي للخلايا المفردة في الاجنه النامية. ونحن نحقق علي المدى الطويل ، وأربعه الابعاد (4D) التصوير من الاجنه الحية c. ايلينيسس مع الدقة المكانية الانسيابية تقريبا من خلال استخدام المزدوج عرض المقلوب الانتقائي الاضاءه الطائرة المجهرية (dispim). النوى والهياكل العصبية في الاجنه الديدان الخيطية واندمجت ايزوتروبيكالي لإنتاج الصور مع دقه ~ 330 نانومتر في جميع الابعاد الثلاثة. وبعد ذلك يتم تحليل مجموعات البيانات رباعيه الابعاد ذات الدقة العالية لربط الهويات النهائية للخلايا بالتعبير الجيني والديناميكيات المورفولوجية عند مستويات التفاصيل أحاديه الخلية والخلوية. تم تنظيم البروتوكول الخاص بنا لتمكين التنفيذ المعياري لكل من الخطوات الموصوفة وتعزيز الدراسات حول تولد الاجنه أو التعبير الجيني أو التطور العصبي.
C. اليجاناس تبرز باعتبارها الكائن الوحيد الذي يمكن ملاحظه كل خليه في الجنين في جميع انحاء النمو العصبي. مع الخلية بأكملها السلالة المعروفة والثابتة1، ومع تطوير أدوات جديده تسمح بوضع العلامات والتصوير المستمر للخلايا واحده في الاجنه ، يمكن لعلماء الاحياء الآن البدء في دراسة خطوات مختلفه في تطوير الديدان الخيطية العصبي النظام من جميع الزوايا-الولادة الخلية. الهجرة والتمايز ؛ تشكيل العصب ، والنمو المستهدف والفاسسيكوليشن ؛ تشكيل المشبك. وضبط الدوائر الوظيفية. التقاط ديناميات الخلايا العصبية الناتجة في الجنين c. اليجس ، من خلال الجمع بين المراسلين والمجهر المجهري المعبر عنه باقتدار ، هو قيمه للمجتمع العلمي.
الدراسات التنموية في c. وغالبا ما الاستفادة من الخلايا الثابتة السلالة وخرائط مصير الخلية من هذا النوع لزيادة فهم السياقية علي مستوي خليه واحده داخل الكائن السليم1. تحليل لصناعه السيارات في الشيخوخة-باستخدام starrynite2،3،4 و اسيتري5،6،7،8 البرمجيات-فوائد من التباين العالي ، وارتفاع القرار صور لنوى الفلورسنت. للعمل علي النحو الأمثل ، StarryNite/اسيتري يعتمد أيضا علي التوجه مقيده يمكن التنبؤ بها من الاجنه الذين تتراوح أعمارهم بين اثناء التنمية. المجهر البؤري ، الذي تم في c. الاجنه التي تم ضغطها بين اثنين من الشفتين ، وكانت الطريقة القياسية لصناعه السيارات في الشيخوخة المجهر لأكثر من عقد لأنه يوفر علي حد سواء عاليه التباين/عاليه الدقة والتي يمكن التنبؤ بها مقيده اتجاه من الجنين7,8. وصفنا سابقا بناء واستخدام رواية الضوء المستندة إلى ورقه مزدوجة المقلوب المجهر الاضاءه الطائرة الانتقائية (dispim) لتصوير عينه حيه مثل الاجنه c. ايليزسيس9،10 , 11 , 12 , 13. ضوء ورقه المجهر ، بشكل عام ، ويوفر السمية الضوئية منخفضه ، وسرعه عاليه ، والتصوير علي المدى الطويل من العينات 3d حيه14،15. الأسلوب diSPIM ، علي وجه التحديد ، وتنتج أربعه الابعاد (4D) الصور مع دقه المكانية تقريبا من 330 نانومتر تقريبا9.
مقارنه مع المجهر البؤري ، diSPIM يقدم اعلي اشاره إلى الضوضاء والسرعة ، والدقة المكانية أكثر الانسيابية ، وأكثر ملاءمة للأجل الطويل في الجسم الصور16. ولذلك عملنا علي تكييف بيانات diSPIM لإدخالها في StarryNite/اسيتري والتحقيق في ما إذا كان هذا من شانه ان يعزز تحليلات الشيخوخة. والعقبة الرئيسية هي ان العينات diSPIM لا يمكن تقييدها بسهوله بواسطة ضغط قشر البيض لاعتماد الاتجاات المتوقعة ل StarryNite/اسيتري. ان الاتجاه العشوائي لمواضع الخلايا في وحده التخزين التي يتم تحليلها يحط من دقه تحليل الاصطفاف التلقائي.
ولذلك استخدمنا العرض الخلوي ، واجهه المستخدم الموجهة للمشاهد والتي تسمح للمستخدمين باختيار الاتجاه الدقيق ثلاثي الابعاد للجنين اثناء المعالجة المسبقة للصور diSPIM ، مما يؤدي إلى بيانات الصورة التي يتم تحسين جودتها وادراك السياق للإدخال في StarryNite السيد/اسيتري. عند اختيار المستخدم من الاجنه الذين تتراوح أعمارهم بين ، والعرض الخلوي تنسق خط أنابيب معالجه البيانات المؤتمتة. يتم حفظ صور الاجنه التي تم اقتصاصها وطرحها في الخلفية ضمن ملفات مكدس TIFF لكل موضع ونقطه زمنيه وطريقه عرض. العرض الخلوي ثم بشكل متكرر يدعو برنامج spimfusion للاشتراك في التسجيل وتفكيكها معا وجات النظر قبل معالجتها ، وذلك باستخدام ريتشاردسون-لوسي17،18 خوارزميه لإنتاج الصور الحجمي عاليه الدقة الانسيابية. تم تحسين مجموعه محدده من المعلمات diSPIM ل StarryNite لتحكم سلوكها اثناء تقسيم الصورة وتتبع النواة في الصور المنصهرة. ثم يتم تحرير الصور تنصهر ونتائج الشيخوخة باستخدام اسيتري, الذي يسمح للمستخدمين لتحديد وإصلاح اي أخطاء في تتبع السلالة السيارات التي تم إنشاؤها بواسطة StarryNite. يمكن أيضا ان تقدم اسيتري شجره النسب والأداءات الثلاثية الابعاد علي غرار النوى المتعقبة في الجنين. نجد ان سرعه الاصطفاف التلقائي والدقة تتعزز بشكل ملحوظ باستخدام الصور المنصهرة ، بالمقارنة مع الصور الخام من كاميرا SPIM. بروتوكول لدينا ، في حين ان الأمثل لتطبيق c. اليجس وصفت هنا ، يمكن تكييفها عموما لصناعه السيارات في الشيخوخة من dispim البيانات المنتجة للأنواع الأخرى أو العينات. إذا كان هذا هو الاستخدام المقصود من البروتوكول ، يرجى ملاحظه ان ضبط اضافيه من المعلمات starrynite من المرجح ان تكون مطلوبه للعينات جديده ، كما هو موضح3،4.
التنفيذ الناجح لهذا البروتوكول ينتج عنه صور ذات دقه رباعيه الابعاد وتمكن علماء الاحياء من تتبع سلاله الخلايا ، مع تحديد وتحليل الخلايا العصبية في نفس الوقت في الجنين النامي. وعلاوة علي ذلك ، من خلال دمج عده خوارزميات ما بعد المعالجة-مع تسارع الاجهزه التي تستهلك الوقت الأكثر من هذه-يمكننا الآن تحليل كل من التفاصيل الفرعية الدقيقة والخلايا الخلوية ومصائر الخلايا من الاجنه الحية في الوقت الحقيقي أساسا. يسمح هذا البروتوكول الجديد بالتلاعب الدقيق والمستنير ومراقبه سلوك الخلية اثناء الدراسات الاثباتيه للتمييز والتكوين الخلوي في الجسم المجري. في هذه المخطوطة ، نقدم شرحا مفصلا للبروتوكولات المحسنة التي قمنا بتطويرها لتتبع السلالات وتعقب الخلايا في تطوير أجنه ج. ايليجنس ، لتعزيز دراسات الاجنه ، التعبير الجيني أو النمو العصبي.
C. اليجاناس تبرز باعتبارها الكائن الوحيد مع المواقف النهائية والاتصال لكل الكبار العصبية المعروفة27. ومع ذلك ، فان الديناميكيات التنموية التي تؤدي إلى تنظيم دوائر العمل والشبكات التي تشكل الاتصالات الخاصة بالعاملين في c. لا تزال غير معروفه. استنادا إلى الفرص الناشئة من التقدم في المجهر الضوئي ، يمكننا الآن التقاط وتحليل مواقف الخلايا ، والتكوين العصبي ، وتكوين الأعصاب في جميع انحاء التنمية الجنينية c. اليجس .
الإجراءات التي وصفناها والتي نستخدمها بشكل روتيني في المختبر تعطي صورا رباعيه الخواص من الخلايا العصبية المسمية ونوى لسلاله الخلايا في الاجنه c. ايلينس . الأهم من ذلك ، لدينا الأمثل ظروف التصوير علي المدى الطويل مع diSPIM والمقرونة قدرات السلالة شبه المؤتمتة مع الصور عاليه الدقة لتحسين سرعه ودقه تحليل الاجنه c. اليجس . هذا البروتوكول المتكامل سيمكن المستخدمين من تصور وتحديد الخلايا والسمات ثلاثية الابعاد مثل الهجرة العصبية والفاسسيكوليشن العصبية من خلال بداية الوخز المبكر. هذا الاجراء يمكن تكييفها بسهوله في اي مرفق مع نظام diSPIM ASI ، ونحن نوصي هذا النظام علي وجه التحديد لهذا البروتوكول. قد تختلف تركيبات SPIM الأخرى المعروضة تجاريا من التكوين ASI في غرفه العينة والخصائص البصرية. ومع ذلك ، يمكن أيضا وضع البيانات المصدرة من منصات أخرى من خلال خط أنابيب البيانات لدينا. ولذلك ، فان تقييم قيمتها في الشيخوخة ، واختبار المطالبة من جوده الصورة واستقرار الصك ، أمر ممكن. علي الرغم من اننا نستخدم بنشاط diSPIM لصوره بانتظام العينات الأخرى (مثل دروفيسيلا والاجنه الزبرافيش) ، لا يزال تحليل السلالات الموصوفة والشاملة من الاجنه تقتصر حاليا علي أنواع الديدان الخيطية. بالنسبة للعينات الكبيرة أو السميكة ، فاننا نختار استخدام نهج المسح الضوئي للمرحلة ، والتي تفحص العينات من خلال ورقه ضوء ثابته. وقد سبق ان أظهرت كومار وآخرون هذا التحسن diSPIM الخضوع للحصول علي صور عاليه الجودة من عينات سميكه دون تعديلات اضافيه علي diSPIM10.
وتشمل الخطوات الهامه داخل البروتوكول تركيب أجنه من طراز c. اليجينز علي المشبك المغطي بالبولي-L-ليسين ، والحصول علي البيانات ، ومعالجه البيانات. حصاد وتركيب الاجنه c. اليجس علي الزجاج كوفيرسليب يمكن ان يكون تحديا للمستخدمين عديمي الخبرة ، ولكن هنا نقدم بروتوكول مفصل من الخطوات الرئيسية لتسهيل التعلم. إذا كان من المرغوب فيه التصوير علي المدى الطويل ، ونحن الحصول علي أفضل النتائج حصاد أربع خلايا أو الاجنه في وقت سابق من 8-10 الشباب البالغين28. لاحظ ان البالغين القدامى اقل رغبه في حصاد الاجنه المرحلة المبكرة لأنها تميل إلى احتواء الاجنه الأكبر سنا في الرحم والبيض غير المخصب. وفيما يتعلق بالاجنه المتصاعدة ، فان المشاكل مثل الانسداد في الشفط المجمع (ماصه الفم) أو الفتحة الكبيرة جدا في الماصة الشعرية المجهرية قد تمنع التركيب السليم للجنين وتوجيهها. للتحضير للتصوير الأمثل ، نقوم باجراء اختبار ما قبل الاستحواذ علي الاجنه المبكرة والمتاخره قبل الوخز للتحقق من أداء الصفائح الضوئية والكاميرات والأهداف والتركيز البؤري التلقائي. نحصل علي أفضل النتائج عندما يتم اختبار جميع هذه العمليات وتسفر عن صور عاليه الجودة خلال اختبارات ما قبل الاستحواذ. وهذا مهم بشكل خاص لتوليد الصور ذات الاستبانة المكانية الانسيابية ، والتي يجب ان تكون الصور الخام المكتسبة من كلا الوجهين (الأهداف) ذات جوده عاليه. بعد اكتساب ، تتم معالجه وحدات التخزين التي تم الحصول عليها لكل طريقه عرض للحصول علي صور الانسيابية. من المهم استخدام بطاقة وحده معالجه الرسومات (GPU) المناسبة كما هو موضح في هذا البروتوكول (انظر أدناه). ويؤدي ذلك إلى تحسين سرعه المعالجة التي يتم بها إنشاء الصور المنصهرة التي يتم دمجها ، وتقصير الوقت في تحليل البيانات. ومن الضروري أيضا ان المستخدمين يقومون بتشغيل أحدث إصدار من سيتوتري وتستخدم المعلمات المقدمة مع حزمه التحميل لدينا ل StarryNite لصناعه السيارات في الشيخوخة. إذا كان المستخدمون مهتمون باستخدام الاصطفاف التلقائي للعينات الأخرى (علي سبيل المثال ، zebrafish ، دروفبيلا الخ) ، سيتطلب الأمر تحسينا إضافيا للمعلمات المستخدمة في starrynite (انظر المراجع3،4).
علي الرغم من ان بروتوكولنا المتكامل يوفر الصور ونتائج الشيخوخة في الجنين قبل الوخز ، يجب علي المستخدمين ان يدركوا ان السلالة اليه في الجنين ما بعد الوخز غير ممكنة حاليا: تتغير المواقع النووية علي ترتيب الثواني في جنين ما بعد الوخز ، بسرعة كبيره جدا للسماح بتتبع النسب. ومع ذلك ، فقد أظهرت dispim بالفعل قدره واعده للتقاط الاحداث العصبية وتتبع بعض المواقع الخلوية في مراحل ما بعد الوخز من الاجنه23،29. إذا كان المستخدمون مهتمون في فحص الجنين ما بعد الوخز ، فان diSPIM لا توفر السرعة للحصول علي لقطات الحجمي وتتبع الاحداث العصبية الدقيقة ، مثل النمو العصبي ، في الاجنه تتحرك بسرعة.
سيكون هذا البروتوكول تاسيسيا لإكمال الخلية بالخلية لوورمجويديس atlas30، حيث انه سيوفر نهجا متكاملا مع صور ذات خواص عاليه الاستبانة لتحديد والتقاط مورفولوجيس ثلاثية الابعاد للخلايا العصبية المسمية اثناء أول 430 دقيقه من تولد الاجنه. وكما هو الوضع ، فان النموذج الاولي لأطلس وورمجويديس يوفر مواقع نوويه للخلايا في الجنين النامي ويهدف إلى التقاط الديناميكيات التنموية لمجموعه فرعيه من الخلايا العصبية الجنينية. سيكون هذا البروتوكول مفتاحا لدمج الخلايا العصبية النامية الاضافيه في أطلس وورمجويديس30.
سيبسط بروتوكولنا المتكامل أيضا استكشاف الملامح الجديدة للتعبيرات الجينية في جنين c. اليجس . في المحور الوراثي c. اليجايليس, العديد من المروجين الخاصة الخلية مكانيا ووقتيا السيطرة علي التعبير عبر الجينات. في حين ان أنماط التعبير من معظم الجينات وقد اتسمت علي نطاق واسع في الحيوانية البالغين31,32,33,34, تقريبا كل ما زال يتعين ان تتميز في البلدان النامية (وخاصه في مرحله متاخره) الجنين. وقد كانت الشركة التشجيعية الخاصة بالديدان موردا مفيدا لمجتمع الدودة لدفع التعبير عن الجينات الخلوية الخاصة بالخلايا ، فضلا عن تحديد ما إذا كانت الوظيفة الجينية مستقله عن الخلية أو غير مستقله. ان التقاط أنماط التعبير الديناميكية عاليه الاستبانة والديناميكية للجينات ، وتحديد الخلايا المعبرة عن طريق الشيخوخة بدقه ، سيكون مفيدا للكثيرين في المجتمع العلمي.
وتتكون الاجنه من عمليتين رئيسيتين متشابكتين ، هما التمايز الخلوي ونشاه الانسجه. يعرف الكثير عن أليات والجزيئات التي تحدد أنواع الخلايا المتميزة اثناء تطوير c. اليجايليس. ومع ذلك ، لا يعرف سوي القليل عن أليات الهامه لهجره الخلايا ، والتصاق الخلايا ، وشكل الخلية في الجنين c. اليجايليس . مع سلاله الخلايا الثابتة c. المعروفة ، يسمح لنا بروتوكولنا بسهوله تمييز التشريح المفهرس ثلاثي الابعاد للجنين خلال المراحل الجديدة من التفصيل: علي سبيل المثال ، محور الفاسسيكوليشن ، synaptogenesis ، والنشاط العصبي. وقد أظهرت ardiel وآخرون في السابق قوه diSPIM للتقاط العابرين الكالسيوم علي مستوي الخلايا العصبية واحده في الاجنه c. ايلينتس 23. العديد من الجوانب الأخرى من فسيولوجيا النمو هي ناضجه للتحقيق من قبل هذه الأساليب.
وأخيرا ، فان هذا البروتوكول إلى حد كبير الألى ويقلل بشكل منهجي من الوقت المستغرق لتوليد الصور غير الحلزونية وأداء خليه الشيخوخة عبر StarryNite و اسيتري. ويمكن تطبيق استراتيجيات البرمجيات المستخدمة في هذا البروتوكول علي العديد من المسائل البيولوجية النائية من المجالات المحددة جدا التي أظهرنا لهم هنا.
تفاصيل حول توافق البرامج والوصول إلى التنزيلات
معلومات عن المدير الجزئي والإضافات للتصوير diSPIM متاحه في http://dispim.org/software/micro-manager و https://micro-manager.org/wiki/ASIdiSPIM_Plugin.
يتطلب خط أنابيب معالجه البيانات حاليا نظام تشغيل Windows. لقد قمنا بتجميع ملف أرشيف واحد لتبسيط تركيب جميع البرامج المطلوبة لمعالجه البيانات وملفات الدعم. انها متاحه للتحميل في http://dispimlineage.wormguides.org.
يعتمد العرض الخلوي (http://run.cytoshow.org/) علي منصة تحليل الصور المستخدمة علي نطاق واسع والمفتوحة المصدر ، ImageJ (v1). يجب تثبيت java وتحديثها علي جهاز الكمبيوتر لاستخدام “العرض الخلوي” ، ويتم نشرها بشكل تلقائي عبر جافا ويب ستارت. العديد من الوظائف المستندة إلى ImageJ من العرض الخلوي كما هو موضح والموضحة في https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html. وقد تم تخصيص العرض الخلوي لعرض البيانات الخام متعددة الابعاد من diSPIM ASI ، فضلا عن غيرها من برامج التصوير التي تخلق TIFF الإخراج. من حيث المبدا ، يمكن دعم أنظمه التصوير SPIM الأخرى متعددة المشاهدات بتعديلات طفيفه لبرنامج العرض الخلوي للسماح بتنفيذ هذا البروتوكول علي أنظمه المجهر المختلفة.
تم كتابه SpimFusion في CUDA/c + + باستخدام Visual Studio 2013 مع مجموعه أدوات CUDA v 7.5. تشغيل SpimFusion يتطلب أجهزه كمبيوتر معينه: بطاقة وحده معالجه الرسومات NVIDIA (GPU) مع CUDA القدرة علي حساب 1.0 أو اعلي والحد الأدنى من 2 غيغابايت ذاكره بطاقة الرسومات. في وقت نشر بروتوكولنا ، SpimFusion غير منشوره (مين قوه وهاري Shroff) ولكنها متوفرة في أرشيف حزمه البرمجيات المذكورة أعلاه.
يتطلب إصدار سطر أوامر مضمن بشكل خاص من StarryNite ان يتم تثبيت وقت تشغيل المحول البرمجي MATLAB المتوفرة بحريه ، ولكن لا يتطلب ترخيصا لبرنامج MATLAB التجارية. يتم تضمين وقت تشغيل المحول البرمجي MATLAB في أرشيف حزمه البرامج المذكورة أعلاه. رمز StarryNite كما هو مستخدم في هذا البروتوكول هو أساسا دون تغيير من تلك المستخدمة في الصور البؤرية6. ومع ذلك ، العديد من المسائل التشغيلية في إنشاء الصور المدخلة لمعالجه StarryNite ومعالجه النتائج StarryNite قد تم تناولها هنا عن طريق أساليب في العرض الخلوي التي تمكن من خط أنابيب معالجه البيانات المستمر لتنصهر الانسيابية diSPIM وحدات التخزين. يتم أتمته هذه التغييرات بواسطة التعليمات البرمجية التي تعالج هذه الخطوات السابقة واللاحقة للمعالجة. كما يقوم العرض الخلوي بتحرير معلمه StarryNite التي تم تحسينها مسبقا والتي تم تعيينها لضبط خوارزميه التجزئة تلقائيا علي كثافة النوى في البيانات التي تم تحديدها. يتم حفظ المعلمات الفريدة المستخدمة من قبل StarryNite علي كل مجموعه بيانات diSPIM في ملف مع صوره الإخراج وبيانات الخط.
الإصدار المخصص من اسيتري الذي يعمل مع الصور ذات 16-بت ويحافظ علي التوافق مع تقديم جافا 3d هو الأنسب لهذا البروتوكول. كما انها مدرجه في أرشيف حزمه البرامج المذكورة أعلاه.
The authors have nothing to disclose.
ونحن نشكر جون موراي لسلاله متكاملة ، ujIs113 ، لتوليد سلاله سلال BV514 ؛ براندون هارفي (NIBIB) للحصول علي مساعده في اختبار البروتوكول; جون دانيلز وغاري Rondeau (الاجهزه العلمية التطبيقية) للحصول علي المساعدة مع مايكرو مدير وأداه diSPIM; وأندرو يورك وهانك عدن لردود فعلهم النقدية علي نظام diSPIM. ونشكر أيضا برنامج مركز البحوث لمؤسسات الأقليات ومعهد خوسيه ديل كاستيلو (جامعه بورتوريكو) علي توفير منبر للاجتماعات والعصف الذهني. وقد اجري الكثير من هذا العمل في المختبر البيولوجي البحري في وودز هول من خلال برنامج ويتمان. وقد تم دعم هذا العمل من قبل البرامج البحثية داخل المعهد الوطني للصحة والتصوير الطبي والهندسة الحيوية والمعاهد القومية للصحة المنح لا. U01-HD075602 ولا. R24-OD016474. تم دعم مارك دبليو مويل من قبل F32-NS098616 و لايتون h. دنكان كان مدعوما بملحق التنوع لR24-OD016474.
Steps 1-4 | |||
Concavity slides | ThermoFisher Scientific | 1519006 | 5-18mm diameter, 0.6-0.8mm deep, 1.2-1.5mm |
Dissecting microscope with 10×–50× zoom range | Motic | SMZ-171 | |
E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
Glass coverslips, no. 1.5, 24 × 50 mm | VWR International | 48393-241 | |
M9 Buffer | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006). | ||
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | H7509-25G | |
Microcapillary pipette aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
Microcapillary pipettes, 0.4-mm i.d | Drummond Scientific | 1-000-800 | |
Needle, no. 18G x 1 ½ (1.2mm x 40mm) | BD Precision Glide | 305196 | |
NGM plates | prepared as described by Brenner (1974) | ||
O-ring for imaging chamber | O-Rings West | M1.5X40 | |
Pasteur pipette | Corning/Sigma-Aldrich | CLS7095D5X | |
Platinum wire, 0.5-mm diameter | Sigma-Aldrich | 267201 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | |
Stainless steel rectangular chamber (76.0 mm x 50.5 mm) | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | I2450 | |
Worm Eyelash Pick | Hart, A. C. Behavior. WormBook. (2006). | ||
Worm Pick | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006). | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Steps 5-6 | |||
488 nm long-pass filter | Semrock | LP02-488 RU-2 | |
561-nm notch filter | Semrock | NF03-561E-25 | |
BLP02-561R-25, quantity 2 | Semrock | 561 nm EdgeBasic best-value long-pass edge filter | |
Control software for bottom camera | Jenoptik | ProgRes CapturePro | |
diSIPM assembly video | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | https://youtu.be/TAgbr6IrTqw ; http://www.asiimaging.com | |
diSPIM alignment video | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | https://youtu.be/qnOrg30NNuE | |
diSPIM imaging PC | Intel | Intel Xeon CPU E5-2630 2.6GHz, 12 cores in total, 64 GB memory, Windows 7 | |
FF01-525/45-25, quantity 2 | Semrock | 525/45 nm BrightLine single-band bandpass filter | |
FF555-DI03-25X36, quantity 2 | Semrock | 555 nm edge BrightLine single-edge dichroic beamsplitter | |
Imaging PC Graphics Card | NVIDIDA | NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards | |
Kumar et al diSPIM Setup | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | Instrument setup for this protocol is identical to Kumar et al 10,11 diSPIM, which makes use of 40x 0.8NA water immersion lenses for imaging. (See steps 5.1 and note) | |
Micro Manager | Micro-Manager | https://micro-manager.org/ | |
Modifications to Kumar et al diSPIM Setup (see below) | |||
Optical table with isolators, 4 feet × 6 feet × 12 inches | TMC | 784-651-02DR and 14-416-34 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Steps 7-10 | |||
Analysis PC | Intel | Intel Core i7-8700K CPU 3.70GHz, 6 cores in total, 64 GB memory, Windows 10 | |
Analysis PC Graphics Card | NVIDIDA | NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards | |
Installation instructions | Software bundle | http://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm | |
Software bundle | Software bundle | http://dispimlineage.wormguides.org |