В Vivo интрацеребральные стереотаксические инъекции для оптогенетической стимуляции дальнобойных входов в mouse Brain Slices
Summary
Этот протокол описывает набор методов для определения клеточного типа специфического функционального подключения долгосрочных входов из отдаленных областей мозга с помощью оптогенетических стимуляций в ломтиках мозга ex vivo.
Abstract
Знание клеточного типа специфических синаптических связей является важнейшей предпосылкой для понимания нейронных цепей в масштабах всего мозга. Функциональное исследование соединений дальнего радиуса действия требует целевых записей одиночных нейронов в сочетании с специфической стимуляцией выявленных удаленных входов. Это часто трудно достичь с помощью обычных и электрических методов стимуляции, потому что аксоны от сходящихся вверх по течению областей мозга может смешение в целевой области. Стереотаксическая ориентация на конкретную область мозга для опосредованного вирусом выражения светочувствительных ионных каналов позволяет селективной стимуляции аксонов, происходящих из этой области со светом. Внутримозговые стереотаксические инъекции могут быть использованы в хорошо разграниченных структурах, таких как передние таламические ядра, в дополнение к другим подкорковышам или корковым областям по всему мозгу.
Описан освоен здесь набор методов для точного стереотаксической инъекции вирусных векторов, выражающих channelrhodopsin в мозге мыши, а затем фотостимуляция аксонтерминалов в подготовке ломтик мозга. Эти протоколы просты и широко применимы. В сочетании с цельноклеточной записи зажима патча с постсинаптически связанного нейрона, фотостимуляция аксонов позволяет обнаруживать функциональные синаптические связи, фармакологическую характеристику и оценивать их прочность. Кроме того, биоцитиновый наполнение записанного нейрона может быть использован для пост-специальной морфологической идентификации постсинаптического нейрона.
Introduction
Определение связи между областями мозга необходимо для понимания нейронных цепей. Классические методы анатомического отслеживания позволяют установить межрегиональную связь, а исследования поражений помогают понять иерархическую организацию информационного потока. Например, мозговые схемы для пространственной ориентации и сигнализации направления головы включают направленный поток информации от таламуса до пресубикула. Это было продемонстрировано исследования поражения антеро-дорсал саломных ядер (ADN), которые ухудшают сигнал направления головы в вниз по течению дорсальный presubiculum, а также парагиппокампальной сетки сигнала ячейки1,2.
Функциональную связь между областями мозга труднее установить на клеточном и субклеточном уровне. В гиппокампе, высокоорганизованная анатомия позволяет исследовать пути конкретных синаптические соединения с помощью электрического моделирования в срез подготовки. Стимулирующие электроды, помещенные в радиат сточки CA1, могут быть использованы специально для стимулирования ввода залога Schaffer от CA33. Стимулирующие электроды, помещенные в молекулярный слой лачуносума CA1, активируют перфорантный вход пути в CA14,5. Электрическая стимуляция активирует высвобождение нейромедиатора из аксонных терминалов; однако, он активирует нейроны с somata вблизи места стимуляции, а также аксоны прохода. Поэтому он имеет ограниченное применение для изучения афферентов из определенных областей мозга, когда волокна различных регионов происхождения перемешивается в целевой структуре, как это обычно бывает в неокортексе.
Нейроны также могут быть стимулированы светом. Оптические методы включают фотоактивацию глутамата в клетке, который можно комбинировать с одно- или двухфотонным лазерным сканированием. Несколько близко расположенных участков могут быть стимулированы последовательно, без механических повреждений ткани6. Это было успешно использовано для картирования синаптических рецепторов, а также активировать отдельные нейроны7. Хотя глутамат неприкосновения могут быть использованы для локального анализа цепи, это не позволяет для конкретной активации дальнего ввода.
Методом выбора для исследования дальнего подключения в нейронных цепях является использование вирусо-опосредованного выражения channelrhodopsin. Используя виво стереотаксические инъекции, описанные здесь, выражение световых ионных каналов может быть целенаправленным и пространственно ограничено желаемой областью мозга. Таким образом, channelrhodopsins эффективны для картирования возбуждающих или ингибирующих подключения из одного региона в свою цель. Трансинфицированные аксоны терминалы могут быть стимулированы светом в подготовке ломтик мозга, и патч-зажим записи как считывание позволяют изучить функции и сильные стороны конкретных компонентов цепи в мозге8. Оптогенетический подход в сочетании со стереотаксической инъекцией вируса предлагает беспрецедентную специфичность и генетический контроль9. Стимулирование со светом дополнительно позволяет как высокой временной и пространственной точности10,11.
Пресубикул является шестислойной корковой структурой при переходе гиппокампа и парагиппокампа формирования12,13. Он получает важный синаптический вход от ADN11, но и от нескольких других корковых и подкорковых областей14. Таким образом, селективная стимуляция таламических аксонов терминалов в пределах presubicular ломтик не представляется возможным с электрической стимуляции, ни глутамата uncaging. Описанные в этом протоколе методы для определения функциональной связи между областями мозга (ADN и presubiculum) с использованием точных стереотаксических инъекций вирусных векторов, выражающих световые каналы. Также описана фотостимуляция аксонов терминалов проецирования нейронов в их целевой области, в сочетании с цельноклеточными зажимными записями постсинаптических нейронов в подготовке среза мозга.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vivo вирусная инъекция для выражения светочувствительных опсинов в определенной области мозга является методом выбора для оптогенетического анализа дальнего функционального подключения10,11,17,18. Стереотаксические ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Бертрана Матона, Мери Нассара, Ли-Вэнь Хуанга и Джина Симоннет за помощь в разработке предыдущих версий протокола стереотаксических инъекций и Марин Мануэль и Патрис аджегузо за техническую помощь. Эта работа была поддержана Французским министерством образования и исследований (L. R., L. S.), Национальным центром Этюдес Spatiales (M. B.), и Национальным agence de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (Д. Ф.).
Materials
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN – 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 – 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
Referências
- Goodridge, J. P., Taube, J. S. Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).
- Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal. Science. 347 (6224), 870-874 (2015).
- Fan, Y., et al. Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h). Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).
- Takahashi, H., Magee, J. C. Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons. Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).
- Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat. Brain Structure & Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).
- Callaway, E. M., Yuste, R. Stimulating neurons with light. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).
- Mao, T., et al. Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex. Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).
- Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).
- Simonnet, J., et al. Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum. Nature Communications. 8, 16032 (2017).
- Nassar, M., et al. Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).
- Fricker, D., et al. Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current. The Journal of Physiology. 587, 4249-4264 (2009).
- Simonnet, J., Eugène, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. Cellular neuroanatomy of rat presubiculum. The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).
- Simonnet, J., Fricker, D. Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system. Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).
- Huang, L. -. W., et al. Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex. eNeuro. 4 (2), (2017).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hass, C. A., Glickfeld, L. L. High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).
