Metoder til test endokrine forstyrrelser i Drosophila melanogaster

Summary

Hormonforstyrrende stoffer (EDC) udgør et alvorligt problem for organismer og for naturlige miljøer. Drosophila melanogaster er en ideel model til at studere EDC effekter in vivo. Her præsenterer vi metoder til at undersøge endokrine forstyrrelser i Drosophila, adressere EDC effekter på frugtbarhed, frugtbarhed, udviklingsmæssige timing, og levetiden af flue.

Abstract

I de seneste år har der været voksende beviser for, at alle organismer og miljøet er udsat for hormon-lignende kemikalier, kendt som endokrine forstyrrende stof kemikalier (edc’er). Disse kemikalier kan ændre den normale balance af endokrine systemer og føre til negative virkninger, samt et stigende antal hormonelle lidelser i den menneskelige befolkning eller forstyrret vækst og reduceret reproduktion i de vilde dyr arter. For nogle Edc’er, der er dokumenteret sundhedsmæssige virkninger og begrænsninger på deres anvendelse. Men for de fleste af dem er der stadig ingen videnskabelige beviser i denne forstand. For at verificere potentielle endokrine virkninger af et kemikalie i hele organismen, er vi nødt til at teste det i passende modelsystemer, samt i frugtflue, Drosophila melanogaster. Her rapporterer vi detaljerede in vivo protokoller for at studere endokrine forstyrrelser i Drosophila, adressere EDC effekter på frugtbarhed/fertilitet, udviklingsmæssige timing, og levetiden af flue. I de sidste par år, vi brugte disse Drosophila liv træk til at undersøge virkningerne af eksponering for 17-α-ethinylestradiol (EE2), Bisphenol A (BPA), og bisphenol AF (BPA F). Tilsammen dækkede disse analyser alle Drosophila livsstadier og gjorde det muligt at evaluere endokrine forstyrrelser i alle hormon-medierede processer. Fecundity/fertilitet og udviklingsmæssige timing analyser var nyttige til at måle EDC indvirkning på flue reproduktionsevne og på udviklingsmæssige stadier, hhv. Endelig, levetid assay involveret kronisk EDC eksponeringer mod voksne og målte deres overlevelse. Men disse livs træk kan også være påvirket af flere eksperimentelle faktorer, der skulle kontrolleres nøje. Så i dette arbejde, foreslår vi en række procedurer, vi har optimeret til det rigtige resultat af disse assays. Disse metoder gør det muligt for videnskabsfolk at etablere endokrine forstyrrelser for ethvert EDC eller for en blanding af forskellige Edc’er i Drosophila, selv om at identificere den endokrine mekanisme ansvarlig for effekten, yderligere essays kunne være behov for.

Introduction

Menneskelige aktiviteter har i miljøet frigivet en massiv mængde kemikalier, som udgør et alvorligt problem for organismer og for naturlige økosystemer¹. Af disse forurenende stoffer anslås det, at omkring 1.000 forskellige kemikalier kan ændre den normale balance af endokrine systemer; Ifølge denne egenskab klassificeres de som endokrine forstyrrende kemikalier (Edc’er). Specifikt, baseret på en nylig definition af endokrine Society, Edc’er er “en eksogen kemiske, eller blanding af kemikalier, der kan forstyrre ethvert aspekt af hormon aktion”². I løbet af de sidste tre årtier har der været voksende videnskabelige beviser for, at edc’er kan påvirke reproduktion og udvikling af dyr og planter^{3,4,5,6,7, 8}. den er Yderligere, EDC eksponering har været relateret til den stigende forekomst af nogle menneskelige sygdomme, herunder kræft, fedme, diabetes, skjoldbruskkirtel sygdomme, og adfærdsmæssige lidelser^9,10,11.

Generelle mekanismer i EDC

På grund af deres molekylære egenskaber opfører edc’er sig som hormoner eller hormon prækursorer^{3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12}. I denne forstand, de kan binde til et hormonreceptor og forstyrre endokrine systemer enten ved at efterligne hormon aktivitet eller ved at blokere endogene hormoner binding. I det første tilfælde, efter binding til receptoren, de kan aktivere det som sin naturlige hormon ville gøre. I det andet tilfælde, binding af EDC til receptoren forhindrer bindingen af dens naturlige hormon, så receptoren er blokeret og kan ikke længere aktiveres, selv i nærværelse af sin naturlige hormon³. Som en konsekvens, kan Edc’er påvirke flere processer, såsom syntese, sekretion, transport, metabolisme, eller perifer virkning af endogene hormoner, der er ansvarlige for opretholdelse af homøostase, reproduktion, udvikling og/eller opførsel af organismen. Receptor binding er ikke den eneste metode, der hidtil er beskrevet for Edc’er. Det er nu klart, at de også kan handle ved at rekruttere koaktivatorer eller corepressorer i enzymatiske veje eller ved at ændre epigenetiske markører deregulerende genekspression^{10,11,12,13 ,14}, med konsekvenser ikke kun for den nuværende generation, men også for sundheden for generationer til at komme⁸.

Drosophila hormoner

De potentielle virkninger af udvalgte Edc’er er blevet undersøgt bredt, både i dyrearter og i flere modelsystemer, hvor endokrine mekanismer er rimeligt velkendte. For hvirvelløse dyr er endokrine systemer, der påvirker vækst, udvikling og reproduktion, blevet udførligt karakteriseret i insekter af flere årsager, hvilket involverer deres omfattende anvendelse inden for biologisk forskning, deres økonomiske betydning og Endelig udvikling af insekticider i stand til at blande sig specifikt med hormonsystemet af skadedyr insekter.

Især blandt insekter, frugtflue D. melanogaster har vist sig at være en meget kraftfuld modelsystem til at vurdere de potentielle endokrine virkninger af edc’er. I D. melanogaster, såvel som i hvirveldyr, spiller hormoner en vigtig rolle i hele livscyklussen. I denne organisme, der er tre vigtigste hormonelle systemer, som involverer steroid hormon 20-hydroxyecdysone (20E)^15,16, sesquiterpenoid juvenil hormon (JH)¹⁷, og Neuro peptider og peptid/protein hormoner¹⁸. Denne tredje gruppe består af flere peptider opdaget for nylig, men klart involveret i et stort udvalg af fysiologiske og adfærdsmæssige processer, såsom lang levetid, homøostase, metabolisme, reproduktion, hukommelse, og lokomotor kontrol. 20E er homologe til kolesterol-afledte steroid hormoner såsom estradiol, mens JH deler nogle ligheder med retinoinsyre; begge af dem er de bedre kendte hormoner i Drosophila^19,20. Deres balance er afgørende i at koordinere støbning og metamorfose, samt i at kontrollere flere post-udviklingsmæssige processer, såsom reproduktion, levetid, og adfærd²¹, således at tilbyde forskellige muligheder for testning endokrine afbrydelse af Drosophila. Yderligere, ecdysteroide hormoner og Jh’er er de vigtigste mål for den såkaldte tredje generations insekticider, der er udviklet til at forstyrre udviklingsmæssige og reproduktive endokrine medierede processer i insekter. Den agonist eller antagonist virkningsmåde af disse kemikalier er velkendt, og dermed kan de tjene som reference standarder for evaluering af virkningerne af potentielle Edc’er om vækst, reproduktion og udvikling af insekter²². F. eks. er methopren, som i vid udstrækning er blevet anvendt til at kontrollere myg og andre akvatiske insekter^23,24, en JH agonist og undertrykker 20E-induceret gentransskription og metamorfose.

Ud over hormoner, den nukleare receptor (NR) super familie i Drosophila er også velkendt; Den består af 18 evolutionært bevaret transkription faktorer, der er involveret i at kontrollere hormon-afhængige udviklingsmæssige veje, samt reproduktion og fysiologi²⁵. Disse hormon-NR’er tilhører alle seks undertyper af NR-familien, herunder dem, der er involveret i neurotransmission²⁶, 2 for retinoinsyre NRS, og dem for steroid-NR’er, der i hvirveldyr udgør et af de primære mål for edcs²⁷.

Drosophila som modelsystem til studier af Edc’er

I øjeblikket, på grundlag af molekylære egenskaber, flere miljøagenturer rundt om i verden tillægger potentialet til at blande sig med de endokrine systemer til forskellige menneskeskabte kemikalier. Da Edc’er er et globalt og allestedsnærværende problem for miljøet og for organismer, er det overordnede mål med forskningen på dette område at reducere deres sygdomsbyrde samt at beskytte levende organismer mod deres skadelige virkninger. For at uddybe forståelsen om de potentielle endokrine virkninger af et kemikalie, er det nødvendigt at teste det in vivo. Til dette formål repræsenterer D. melanogaster et gyldigt modelsystem. Til dato er frugtflue blevet flittigt anvendt som in vivo model til at vurdere virkningerne af flere miljømæssige Edc’er; Det er blevet rapporteret, at eksponeringen for flere edc’er, såsom dibutylphthalatfyldte phthalat (DBP)²⁸, Bisphenol a (BPA), 4-nonylphenol (4-NP), 4-tert-Octylphenol (4-tert-op)²⁹, methylparaben (MP)³⁰, ethylparaben (EP)^{31, 32}, bis-(2-ethylhexyl) phthalat (dehp)³³og 17-α-ethinylestradiol (EE2)³⁴, påvirker metabolisme og endokrine funktioner som i hvirveldyr modeller. Flere grunde har ført til, at det er blevet brugt som model på dette forskningsområde. Ud over en fremragende viden om sine endokrine systemer, yderligere fordele omfatter sin korte livscyklus, lave omkostninger, let manipulerbare genom, en lang historie af forskning, og flere tekniske muligheder (Se FlyBase hjemmeside, http://flybase.org/). D. melanogaster giver også en effektiv model til let at studere Trans generations effekter og befolkningens respons på miljøfaktorer⁸ og undgår etiske spørgsmål, der er relevante for in vivo-undersøgelser af højere dyr. Desuden, frugtflue deler en høj grad af genbevaring med mennesker, som kan gøre det muligt for Drosophila EDC analyser til at hjælpe med at forudsige eller foreslå potentielle virkninger af disse kemikalier for menneskers sundhed. Ud over at udvide forståelsen om menneskers sundhed virkninger, Drosophila kan bidrage til at vurdere risiciene for EDC eksponering for miljøet, såsom biodiversitet tab og miljøforringelse. Endelig giver frugtfluen den yderligere fordel, at den anvendes i laboratorier, hvor de faktorer, der potentielt påvirker dens udvikling, reproduktion og levetid, kan holdes under kontrol for at tilskrive enhver variation af det stof, der skal testes.

Med dette i tankerne, har vi optimeret enkle og robuste fitness analyser til bestemmelse af EDC effekter på nogle Drosophila hormonelle træk, såsom frugtbarhed/fertilitet, udviklingsmæssige timing, og voksen levetid. Disse analyser har været almindeligt anvendt til nogle edcs^{23,24,25,26,27}. Især har vi brugt følgende protokoller til at vurdere virkningerne af eksponeringen for syntetisk østrogen EE2³⁴ og til BPA og til Bisphenol af (BPA F) (ikke-offentliggjorte data). Disse protokoller kan let ændres for at undersøge virkningerne af en given EDC på et tidspunkt, samt de kombinerede virkninger af flere Edc’er i D. melanogaster.

Protocol

1. tilberedning af fødevarer Til vedligeholdelse af lageret og til vækst af larve skal der anvendes et korn mel, der indeholder 3% pulveriseret gær, 10% saccharose, 9% forooked majsmel, 0,4% agar, derefter kaldet majsmel medium (cm). Sæt 30 g gær i 100 mL ledningsvand, Bring det i kog og lad det koge i 15 min. Hver for sig blandes godt 90 g forkogt majsmel, 100 g sukker og 4 g agar i 900 mL ledningsvand. Bring opløsningen i kog, Sænk varmen og kog i 5 min…

Representative Results

I dette afsnit rapporteres de vigtigste trin i ovennævnte protokoller i form af forenklede ordninger. I betragtning af at fluer har tendens til at undgå ubehagelige forbindelser, den første ting at gøre, er at assay smagen af den valgte EDC. Dette kan gøres ved at blande en fødevare farve (for eksempel, rød mad Dye No. 40)35 med den mad suppleret med den valgte EDC i forskellige doser eller med opløsningsmidlet alene. Fluer fodret på disse medier er undersøgt under en stereo mikroskopi o…

Discussion

Frugtflue D. melanogaster er blevet flittigt ansat som et in vivo modelsystem til at undersøge de potentielle virkninger af miljømæssige edc’er såsom DBP²⁸, BPA, 4-NP, 4-tert-op²⁹, MP³⁰, EP^{31, 32}, DEHP³³og EE2³⁴. Flere grunde har ført til, at det er blevet brugt som model på dette forskningsområde. Bortset fra sine ubestridte fo…

Materials

17α-Ethinylestradiol	Sigma	E4876-1G
Agar for Drosophila medium	BIOSIGMA	789148
Bisphenol A	Sigma	239658-50G
Bisphenol AF	Sigma	90477-100MG
Cornmeal	CA' BIANCA
Diethyl ether	Sigma
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789008	25×95 mm
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789009	29×95 mm
Drosophila Vials	Kaltek	187	22X63
Embryo collection cage	Crafts		Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying
Ethanol	FLUKA	2860
Etherizer	Crafts		cylindrical glass container with a cotton plug
Glass Bottle			250mL Bottles
Glass Vials	Microtech	ST 10024	FLAT BOTTOM TUBE 100X24
Hand blender Pimmy	Ariete		food processor
Instant Success yeast	ESKA		Powdered yeast
Laying tray	Crafts		plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying
Methyl4-hydroxybenzoate	SIGMA	H5501
Petri Dish	Falcon	351016	60×5
Red dye no. 40	SIGMA	16035
Stereomicroscope with LED lights	Leica		S4E
Sucrose	HIMEDIA	MB025
Tomato sauce	Cirio