Methoden zur Prüfung der endokkrinen Disruption bei Drosophila melanogaster
Summary
Endokrine Disruptorchemikalien (EDCs) stellen ein ernstes Problem für Organismen und natürliche Umgebungen dar. Drosophila melanogaster stellt ein ideales Modell dar, um EDC-Effekte in vivo zu untersuchen. Hier stellen wir Methoden zur Untersuchung der endokrineStörung in Drosophila vor, die EDC-Effekte auf Fruchtbarkeit, Fruchtbarkeit, Entwicklungszeitpunkt und Lebensdauer der Fliege adressieren.
Abstract
In den letzten Jahren mehren sich die Hinweise, dass alle Organismen und die Umwelt hormonähnlichen Chemikalien ausgesetzt sind, die als endokrine Disruptorchemikalien (EDCs) bekannt sind. Diese Chemikalien können das normale Gleichgewicht der endokrinen Systeme verändern und zu negativen Auswirkungen führen, sowie eine zunehmende Anzahl von hormonellen Störungen in der menschlichen Bevölkerung oder gestörtes Wachstum und verminderte Fortpflanzung in den Wildtierarten. Für einige EDCs gibt es dokumentierte gesundheitliche Auswirkungen und Einschränkungen für ihre Verwendung. Für die meisten von ihnen gibt es jedoch immer noch keine wissenschaftlichen Beweise in diesem Sinne. Um mögliche endokrine Wirkungen einer Chemikalie im vollwertigen Organismus zu überprüfen, müssen wir sie in geeigneten Modellsystemen sowie in der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster,testen. Hier berichten wir über detaillierte In-vivo-Protokolle zur Untersuchung endokriner Störungen in Drosophila, die edC-Effekte auf die Fruchtbarkeit/Fruchtbarkeit, den Entwicklungszeitpunkt und die Lebensdauer der Fliege angehen. In den letzten Jahren haben wir diese Drosophila-Lebensmerkmale verwendet, um die Auswirkungen der Exposition gegenüber 17-Ethinylestradiol (EE2), Bisphenol A (BPA) und Bisphenol AF (BPA F) zu untersuchen. Insgesamt deckten diese Assays alle Drosophila-Lebensstadien ab und ermöglichten es, endokrine Störungen in allen hormonvermittelten Prozessen zu bewerten. Fecundity/Fertility und Developmental Timing Assays waren nützlich, um die Auswirkungen des EDC auf die Reproduktivleistung der Fliege bzw. auf die Entwicklungsstadien zu messen. Schließlich umfasste der Lebensdauertest chronische EDC-Expositionen bei Erwachsenen und maß deren Überleben. Diese Lebensmerkmale können jedoch auch durch mehrere experimentelle Faktoren beeinflusst werden, die sorgfältig kontrolliert werden mussten. In dieser Arbeit schlagen wir daher eine Reihe von Verfahren vor, die wir für das richtige Ergebnis dieser Assays optimiert haben. Diese Methoden ermöglichen es Wissenschaftlern, endokrine Störungen für jedes EDC oder für eine Mischung verschiedener EDCs in Drosophila festzustellen, obwohl zur Identifizierung des für die Wirkung verantwortlichen endokkrinen Mechanismus weitere Essays erforderlich sein könnten.
Introduction
Menschliche Aktivitäten haben eine enorme Menge an Chemikalien in die Umwelt freigesetzt, die ein ernstes Problem für Organismen und für natürliche Ökosysteme darstellen1. Von diesen Schadstoffen wird geschätzt, dass etwa 1.000 verschiedene Chemikalien das normale Gleichgewicht der endokrinen Systeme verändern können; nach dieser Eigenschaft werden sie als endokrine störende Chemikalien (EDCs) klassifiziert. Insbesondere auf der Grundlage einer kürzlichen Definition der Endokrinen Gesellschaft sind die EDCs “eine exogene Chemikalie oder eine Mischung von Chemikalien, die jeden Aspekt der Hormonwirkung beeinträchtigen können”2. In den letzten drei Jahrzehnten hat es immer mehr wissenschaftliche Beweise dafür gegeben, dass EDCs die Fortpflanzung und Entwicklung von Tieren und Pflanzen beeinflussen können3,4,5,6,7, 8. Darüber hinaus wurde die EDC-Exposition mit der zunehmenden Prävalenz einiger menschlicher Krankheiten zusammen, einschließlich Krebs, Fettleibigkeit, Diabetes, Schilddrüsenerkrankungen und Verhaltensstörungen9,10,11.
Allgemeine Mechanismen der EZ
Aufgrund ihrer molekularen Eigenschaften verhalten sich EDCs wie Hormone oder Hormonvorläufer3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. In diesem Sinne, Sie können an einen Hormonrezeptor binden und stören endokrine Systeme entweder durch Nachahmung der Hormonaktivität oder durch Blockierung endogene Hormone Bindung. Im ersten Fall, nach der Bindung an den Rezeptor, Sie können es aktivieren, wie sein natürliches Hormon tun würde. Im anderen Fall verhindert die Bindung des EDC an den Rezeptor die Bindung seines natürlichen Hormons, so dass der Rezeptor blockiert ist und auch in Gegenwart seines natürlichen Hormons3nicht mehr aktiviert werden kann. Infolgedessen können EDCs mehrere Prozesse beeinflussen, wie die Synthese, Sekretion, Transport, Stoffwechsel oder periphere Wirkung von endogenen Hormonen, die für die Aufrechterhaltung der Homöostase, Fortpflanzung, Entwicklung und/oder Verhalten von den Organismus. Die Rezeptorbindung ist nicht die einzige bisher beschriebene Wirkungsweise für die EDCs. Es ist jetzt klar, dass sie auch handeln können, indem sie Koaktivatoren oder Corepressoren in enzymatischen Bahnen rekrutieren oder epigenetische Marker modifizieren, die die Genexpression10,11,12,13 deregulieren. ,14, mit Folgen nicht nur für die aktuelle Generation, sondern auch für die Gesundheit der kommenden Generationen8.
Drosophila-Hormone
Die potenziellen Auswirkungen ausgewählter EDCs wurden umfassend untersucht, sowohl bei Tierarten als auch in mehreren Modellsystemen, in denen endokrine Mechanismen einigermaßen gut bekannt sind. Bei wirbellosen Tieren wurden endokrine Systeme, die Wachstum, Entwicklung und Fortpflanzung beeinflussen, bei Insekten aus mehreren Gründen stark charakterisiert, was ihre umfangreiche Verwendung im Bereich der biologischen Forschung, ihre wirtschaftliche Bedeutung und schließlich die Entwicklung von Insektiziden, die in der Lage sind, speziell in das Hormonsystem von Schädlingsinsekten einzugreifen.
Insbesondere unter Insekten hat sich die Fruchtfliege D. melanogaster als ein sehr leistungsfähiges Modellsystem zur Bewertung der möglichen endokrinen Wirkungen von EDCs erwiesen. Bei D. melanogaster, sowie bei Wirbeltieren, Hormone spielen eine wichtige Rolle über den gesamten Lebenszyklus. In diesem Organismus gibt es drei Haupthormonsysteme, die das Steroidhormon 20-Hydroxyecdyson (20E)15,16, das sesquiterpenoide Juvenile Hormon (JH)17, und die Neuropeptide und Peptid/Protein beinhalten Hormone18. Diese dritte Gruppe besteht aus mehreren Peptiden, die in jüngerer Zeit entdeckt wurden, aber eindeutig an einer Vielzahl von physiologischen und Verhaltensprozessen beteiligt sind, wie Langlebigkeit, Homöostase, Stoffwechsel, Reproduktion, Gedächtnis und Bewegungssteuerung. 20E ist homologe zu Cholesterin-abgeleiteten Steroidhormonen wie Estradiol, während JH einige Ähnlichkeiten mit Retinsäure teilt; beide sind die bekannteren Hormone in Drosophila19,20. Ihr Gleichgewicht ist entscheidend für die Koordination von Molting und Metamorphose sowie für die Steuerung mehrerer postentwicklungsmäßiger Prozesse, wie Fortpflanzung, Lebensdauer und Verhalten21, und bietet somit verschiedene Möglichkeiten zur Erprobung endokriner Störung in Drosophila. Darüber hinaus sind Ecdysteroidhormone und JHs die Hauptziele der sogenannten Insektizide der dritten Generation, die entwickelt wurden, um entwicklungs- und reproduktive endokrine Prozesse bei Insekten zu stören. Die agonistische oder antagonistische Wirkungsweise dieser Chemikalien ist bekannt und kann daher als Referenzstandards für die Bewertung der Auswirkungen potenzieller EDCs auf das Wachstum, die Fortpflanzung und die Entwicklung von Insekten dienen22. Zum Beispiel, Methopren, das weit verbreitet bei der Bekämpfung von Mücken und anderen Wasserinsekten23,24, arbeitet als JH-Agonist und unterdrückt 20E-induzierte Gentranskription und Metamorphose.
Neben Hormonen ist auch die Superfamilie des Nuklearrezeptors (NR) in Drosophila bekannt; Es besteht aus 18 evolutionär konservierten Transkriptionsfaktoren, die an der Kontrolle hormonabhängiger Entwicklungspfade sowie Reproduktion und Physiologie25beteiligt sind. Diese Hormon NRs gehören zu allen sechs NR-Überfamilie Subtypen, einschließlich der an der Neurotransmissionbeteiligt 26, zwei für Retinsäure NRs, und diejenigen für Steroid NRs, die bei Wirbeltieren, eines der primären Ziele von EDCs27darstellen.
Drosophila als Modellsystem zum Studium von EDCs
Derzeit führen mehrere Umweltagenturen auf der ganzen Welt auf der Grundlage molekularer Eigenschaften das Potenzial, die endokrinen Systeme zu stören, verschiedenen vom Menschen hergestellten Chemikalien zu. Da die EDC ein globales und allgegenwärtiges Problem für die Umwelt und für Organismen darstellen, besteht das übergeordnete Ziel der Forschung auf diesem Gebiet darin, ihre Krankheitslast zu verringern und lebende Organismen vor ihren nachteiligen Auswirkungen zu schützen. Um das Verständnis über die möglichen endokrinen Wirkungen einer Chemikalie zu vertiefen, ist es notwendig, sie in vivo zu testen. Zu diesem Zweck stellt D. melanogaster ein gültiges Modellsystem dar. Bis heute wurde die Fruchtfliege ausgiebig als In-vivo-Modell verwendet, um die Auswirkungen mehrerer Umwelt-EDCs zu bewerten; Es wurde berichtet, dass die Exposition gegenüber mehreren EDCs, wie Dibutylphthalat (DBP)28, Bisphenol A (BPA), 4-Nonylphenol (4-NP), 4-tert-octylphenol (4-tert-OP)29, Methylparaben (MP)30, Ethylparaben (EP)31, 32, bis-(2-ethylhexyl) phthalat (DEHP)33, und 17-a-ethinylestradiol (EE2)34, beeinflusst den Stoffwechsel und die endokrinen Funktionen wie bei Wirbeltiermodellen. Mehrere Gründe haben dazu geführt, dass er als Modell in diesem Forschungsbereich verwendet wurde. Neben der hervorragenden Kenntnis seiner endokrinen Systeme sind weitere Vorteile sein kurzer Lebenszyklus, niedrige Kosten, leicht zu manipulierbares Genom, eine lange Forschungsgeschichte und mehrere technische Möglichkeiten (siehe FlyBase-Website, http://flybase.org/). D. melanogaster bietet auch ein leistungsfähiges Modell für die einfache Untersuchung der transgenerationalen Effekte und Der Population Reaktionen auf Umweltfaktoren8 und vermeidet ethische Fragen, die für In-vivo-Studien an höheren Tieren relevant sind. Darüber hinaus teilt die Fruchtfliege ein hohes Maß an Generhaltung mit menschenweisen, was es Drosophila EDC-Assays ermöglichen könnte, bei der Vorhersage oder Demindizierung möglicher Auswirkungen dieser Chemikalien auf die menschliche Gesundheit zu helfen. Neben der Erweiterung des Verständnisses über die Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit kann Drosophila dazu beitragen, die Risiken einer EDC-Exposition gegenüber der Umwelt, wie den Verlust der biologischen Vielfalt und die Umweltzerstörung, zu bewerten. Schließlich bietet die Fruchtfliege den zusätzlichen Vorteil, in Laboratorien eingesetzt zu werden, in denen die Faktoren, die ihre Entwicklung, Fortpflanzung und Lebensdauer beeinflussen, unter Kontrolle gehalten werden können, um jede Variation dem zu prüfenden Stoff zuzuschreiben.
Vor diesem Hintergrund haben wir einfache und robuste Fitness-Assays optimiert, um EDC-Effekte auf einige Drosophila-Hormonmerkmale wie Fruchtbarkeit/Fruchtbarkeit, Entwicklungszeitpunkt und Erwachsenenlebensdauer zu bestimmen. Diese Assays wurden weit verbreitet für einige EDCs23,24,25,26,27verwendet. Insbesondere haben wir die folgenden Protokolle verwendet, um die Auswirkungen der Exposition gegenüber dem synthetischen Östrogen EE234 und BPA und Bisphenol AF (BPA F) (unveröffentlichte Daten) zu bewerten. Diese Protokolle können leicht geändert werden, um die Auswirkungen eines bestimmten EDC zu einem Zeitpunkt zu untersuchen, sowie die kombinierten Wirkungen mehrerer EDCs in D. melanogaster.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Fruchtfliege D. melanogaster wurde ausgiebig als In-vivo-Modellsystem eingesetzt, um die potenziellen Auswirkungen von Umwelt-EDCs wie DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31, 32, DEHP33und EE234. Mehrere Gründe haben seine Verwendung als Modell in diesem Forschungsbereich geführt. Abgesehen von seinen unbestrittenen Vorteilen …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Orsolina Petillo für die technische Unterstützung. Die Autoren danken Dr. Mariarosaria Aletta (CNR) für die bibliographische Unterstützung. Die Autoren danken Dr. Gustavo Damiano Mita für die Einführung in die EDC-Welt. Die Autoren danken Leica Microsystems und Pasquale Romano für ihre Unterstützung. Diese Forschung wurde vom Projekt PON03PE_00110_1 unterstützt. “Sviluppo di nanotecnologie Orientate alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica” acronimo “SORRISO”; Committente: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Projekt PO FESR Kampanien 2007-2013 “NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE”.
Materials
| 17α-Ethinylestradiol | Sigma | E4876-1G | |
| Agar for Drosophila medium | BIOSIGMA | 789148 | |
| Bisphenol A | Sigma | 239658-50G | |
| Bisphenol AF | Sigma | 90477-100MG | |
| Cornmeal | CA' BIANCA | ||
| Diethyl ether | Sigma | ||
| Drosophila Vials | BIOSIGMA | 789008 | 25×95 mm |
| Drosophila Vials | BIOSIGMA | 789009 | 29×95 mm |
| Drosophila Vials | Kaltek | 187 | 22X63 |
| Embryo collection cage | Crafts | Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying | |
| Ethanol | FLUKA | 2860 | |
| Etherizer | Crafts | cylindrical glass container with a cotton plug | |
| Glass Bottle | 250mL Bottles | ||
| Glass Vials | Microtech | ST 10024 | FLAT BOTTOM TUBE 100X24 |
| Hand blender Pimmy | Ariete | food processor | |
| Instant Success yeast | ESKA | Powdered yeast | |
| Laying tray | Crafts | plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying | |
| Methyl4-hydroxybenzoate | SIGMA | H5501 | |
| Petri Dish | Falcon | 351016 | 60×5 |
| Red dye no. 40 | SIGMA | 16035 | |
| Stereomicroscope with LED lights | Leica | S4E | |
| Sucrose | HIMEDIA | MB025 | |
| Tomato sauce | Cirio |
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