जिका वायरस की हाल ही में महामारी टीकों और/या चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण स्थापित करने के महत्व पर प्रकाश डाला गया। यहाँ, हम एक पूर्ण लंबाई cDNA क्लोन मानव साइटोमेगागोवायरस तत्काल-early प्रमोटर के नियंत्रण में एक जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र में इकट्ठे से एक संक्रामक रिकॉमबिनेंट जिका वायरस को बचाने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन.
हाल ही में दुनिया भर में फैलने के दौरान स्नायविक जटिलताओं के साथ जिका वायरस (जेडआईकेवी) संक्रमण के सहयोग और अनुमोदित टीकों की कमी और / जेडआईकेवी जीव विज्ञान का अध्ययन और चिकित्सीय और/या रोगनिरोधी दृष्टिकोणों का विकास। हालांकि, अन्य flaviviruses के साथ की तरह, बैक्टीरिया में इसके प्रवर्धन के दौरान वायरल दृश्यों की विषाक्तता के कारण जेडआईकेवी पूर्ण लंबाई संक्रामक cDNA क्लोन की पीढ़ी बाधित किया गया है। इस समस्या को दूर करने के लिए, हमने जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्रों (बीएसी) के उपयोग के आधार पर एक गैर-पारंपरिक दृष्टिकोण विकसित किया है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, IKV तनाव रियो ग्रांडे Norte नेटाल (ज़िकेवी-RGN) की पूर्ण लंबाई cDNA प्रतिलिपि चार सिंथेटिक डीएनए टुकड़े से उत्पन्न होता है और मानव साइटोमेगागोवायरस (CMV) के नियंत्रण में एकल प्रतिलिपि pBeloBAC11 प्लाज्मिड में इकट्ठे तत्काल-पूर्व प्रमोटर. इकट्ठे BAC cDNA क्लोन बैक्टीरिया में संचरण के दौरान स्थिर है, और संक्रामक पुनः संयोजक (आर) जेडआईकेवी बीएसी cDNA क्लोन के transfection के बाद वेरो कोशिकाओं में बरामद किया जाता है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल flaviviruses के संक्रामक क्लोन की पीढ़ी के लिए एक शक्तिशाली तकनीक प्रदान करता है, सहित ]IKV, और अन्य सकारात्मक खिंचाव आरएनए वायरस, विशेष रूप से बड़े जीनोम के साथ उन है कि जीवाणु के दौरान स्थिरता की समस्या है संचरण|
$iKV Flaviviridae परिवार है कि वर्तमान में एक वैश्विक सार्वजनिक स्वास्थ्य आपातकालीन1का गठन के भीतर Flavivirus जीनस के एक मच्छर जनित सदस्य है. अन्य फ्लेवीवायरस की तरह, जेडीकेवी एक लिफाफावाला आरएनए वायरस है जिसकी एक मूर्ति-जैसे संरचना होती है जिसमें लगभग 10.8 केबी का एक सकारात्मक अर्थ होता है, एकल-संक्षिप्त आरएनए अणु (चित्र 1)2। वायरल जीनोम लगभग 3,423 एमिनो एसिड का एक बड़ा पॉलीप्रोटीन को एन्कोड करता है जिसे वायरल और सेलुलर प्रोटीज़ द्वारा तीन संरचनात्मक प्रोटीनों में संसाधित किया जाता है (कैप्सिड [सी], प्रीमेम्ब्रेन/मेम्ब्रेन [पीआरएम/एम], और लिफाफा [ई]) जो कि के गठन में शामिल हैं वायरल कणों और सात nonstructural (एनएस) प्रोटीन (NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, और NS5) कि जीनोम प्रतिकृति में भाग लेने, वायरस विधानसभा, और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की चोरी (चित्र 1)3.
ऐतिहासिक रूप से, जेडीकेवी संक्रमण एक हल्के febrile बीमारी के साथ जुड़ा हुआ है4,5. हालांकि, दक्षिण और मध्य अमेरिका, दक्षिण प्रशांत, और कैरेबियन 6,7,8, और Guillain-Barr] सिंड्रोम की घटना के साथ अपने सहयोग भर में $iKV संक्रमण के विस्फोटक हाल ही में महामारी और माइक्रोसेफेली9,10,11, 12,13, ऐतिहासिक धारणा को बदल दिया है और एक महत्वपूर्ण मानव रोगज़नक़ के रूप में जेडीकेवी की प्रासंगिकता को शक्तिशाली किया है । इस अर्थ में, संक्रामक सीडीएनए क्लोन जैसे आणविक उपकरणों के विकास से वायरल रोगजनन के अध्ययन और आनुवंशिक रूप से परिभाषित टीकों के विकास और जेडआईकेवी संक्रमण के उपचार के लिए एंटीवायरल दवाओं की पहचान की सुविधा होगी। के रूप में अन्य flaviviruses के लिए वर्णित है, वायरल जीनोम14 में गुप्त जीवाणु प्रमोटरों की उपस्थिति के कारण जीआईकेवी संक्रामक क्लोन की पीढ़ी मुश्किल है कि के प्रचार के दौरान विषाक्त वायरल प्रोटीन की लीक अभिव्यक्ति की अनुमति cDNA बैक्टीरिया में क्लोन मानक उच्च प्रतिलिपि संख्या प्लाज्मिड15,16,17का उपयोग कर . इस विषाक्तता की समस्या को दूर करने के लिए पिछलेदो वर्षों में कई गैर-परंपरागत दृष्टिकोणों को सफलतापूर्वक कार्यान्वित किया गया है। इनमें कम कॉपी-नंबर प्लाज्मिड19,20, विषाक्त क्षेत्रों को बाधित करने के लिए इनट्रॉन्स की प्रविष्टि21,22,23, सी डीएनए टुकड़ों के इनविट्रो लिगेशन का उपयोग शामिल है। 24 , 25, वायरल जीनोम में मौजूद गुप्त जीवाणु प्रमोटरों के उत्परिवर्तन मौन26,27, संक्रामक subgenomic amplicons (ISA )28,29, गिब्सन विधानसभा विधि30 और गोल बहुलक विस्तार अभिक्रिया (सीईईआर)31का उपयोग।
इसमें, हम एक पूर्ण लंबाई cDNA क्लोन की इंजीनियरिंग के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन ]IKV तनाव ]IKV-RGN13, एक बीएसी का उपयोग करने के लिए विषाक्तता की समस्या पर काबू पाने के लिए, और BAC CDNA क्लोन के प्रत्यक्ष transfection द्वारा संक्रामक r$IKV के बचाव Vero में कोशिकाओं32, मानव टीकों के विकास के लिए खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा अनुमोदित एक सेल लाइन33. इस प्रणाली में, वायरल जीनोम की पूर्ण लंबाई cDNA प्रतिलिपि बीएसी प्लाज्मिड pBeloBAC1134 में इकट्ठा किया जाता है (चित्र 2A), एक कम प्रतिलिपि संख्या प्लाज्मिड (एक से दो प्रतियां प्रति सेल) Escherichia कोलाई एफ कारक35से व्युत्पन्न , जो बैक्टीरिया में इसके प्रसार के दौरान flavivirus दृश्यों की विषाक्तता को कम करता है. $IKV जीनोम के cDNA मानव CMV तत्काल-early प्रमोटर के नियंत्रण में pBeloBAC11 में इकट्ठा किया जाता है, सेलुलर आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय द्वारा transfected कोशिकाओं के नाभिक में वायरल (v)RNA की अभिव्यक्ति की अनुमति देने के लिए, और हेपेटाइटिस द्वारा 3’अंत में flanked डेल्टा वायरस (HDV) ribozyme (आरजेड), गोजातीय वृद्धि हार्मोन के दृश्यों के बाद (BGH) समाप्ति और polyadenylation संकेतों के लिए सिंथेटिक RNAs असर प्रामाणिक 5′- और वायरल जीनोम के 3′-ends, क्रमशः (चित्र 2B) . इस cDNA शुरू प्रणाली छाया हुआ वायरल आरएनए के intracellular अभिव्यक्ति में परिणाम है, एक इन विट्रो प्रतिलेखन कदम के लिए आवश्यकता के बिना संक्रामक जेडआईकेवी की वसूली की अनुमति. बीएसी दृष्टिकोण अन्य flaviviruses के लिए स्थिर और पूरी तरह कार्यात्मक संक्रामक cDNA क्लोन के निर्माण के लिए लागू एक शक्तिशाली पद्धति प्रदान करता है, साथ ही अन्य सकारात्मक फंसे आरएनए वायरस36,37, 38,39,40,41.
संक्रामक cDNA क्लोन आरएनए वायरस के बुनियादी अनुसंधान और टीकों के विकास के लिए आवश्यक आणविक उपकरण का गठन और / हालांकि, flaviviruses सहित कई सकारात्मक-संक्षिप्त आरएनए वायरस के लिए, संक्रामक cDNA क्लोन की पीढ़ी क्लोन सीडीएनए की अस्थिरता के कारण मुश्किल है जब मानक उच्च-कॉपी-संख्या प्लाज्मिड का उपयोग करके बैक्टीरिया में प्रचारित किया जाता है। जेडआईकेवी और अन्य फ्लेवीवायरस के मामले में, यह अस्थिरता मुख्य रूप से वायरल जीनोम14,15,16,17 में मौजूद गुप्त जीवाणु प्रमोटरों से विषाक्त वायरल प्रोटीन की लीक अभिव्यक्ति के कारण है . यहाँ, हम एक स्थिर और शक्तिशाली प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एक स्थिर $IKV पूर्ण लंबाई संक्रामक cDNA क्लोन एक एकल प्लाज्मिड के रूप में उत्पन्न करने के लिए, बीएसी प्लाज्मिड pBeloBAC1134 के उपयोग के आधार पर (चित्र 2A) विषाक्तता समस्या को दूर करने के लिए, का उपयोग CMV प्रमोटर transfected कोशिकाओं के नाभिक में vRNA की अभिव्यक्ति की अनुमति देने के लिए, और HDV आर $ सटीक 3′-ends के साथ vRNAs उत्पन्न करने के लिए (चित्र 2B)। इस विधि का उपयोग करके, हमने सफलतापूर्वक जेडआईकेवी तनाव आरजीएन का एक पूरी तरह से स्थिर संक्रामक क्लोन उत्पन्न किया है जो अतिसंवेदनशील वेरो कोशिकाओं के प्रत्यक्ष ट्रांसफेक्शन के बाद संक्रामक आरजेडआईकेवी के कुशल और विश्वसनीय वसूली की अनुमति देता है (चित्र 3 औरचित्र 3 और चित्र 4) .
पिछले कुछ वर्षों में एक बड़ा प्रयास किया गया है कि $IKV संक्रामक cDNA क्लोन के साथ जुड़े अस्थिरता की समस्याओं को दूर करने के लिए, और कई दृष्टिकोण सफलतापूर्वक18लागू किया गया है , cDNA टुकड़े 24 के इन विट्रो लिगेशन सहित ,25, कम कॉपी प्लाज्मिड19,20, मूक उत्परिवर्तनों की शुरूआत से गुप्त जीवाणु प्रवर्तकों की निष्क्रियता26,27, इनट्रॉन प्रविष्टि21, 22 , 23, गिब्सन विधानसभा विधि30, ISA विधि28,29, और CPER31का उपयोग करें . हालांकि इन दृष्टिकोण विषाक्तता की समस्या को दूर करने और IKV संक्रामक cDNA क्लोन उत्पन्न करने के लिए उपयोगी होते हैं, उनमें से कुछ परिश्रमी हैं और कई नुकसान मौजूद हैं, इन विट्रो लिगेशन और प्रतिलेखन कदम है कि वायरस को कम करने के लिए की आवश्यकता सहित वसूली दक्षता या चुप उत्परिवर्तनों की एक उच्च संख्या की शुरूआत गुप्त जीवाणु प्रमोटर है कि वायरल फिटनेस को प्रभावित कर सकता है निष्क्रिय करने के लिए, दूसरों के बीच. इस प्रोटोकॉल में वर्णित दृष्टिकोण निम्न लाभ प्रस्तुत करता है। i) बीएसी प्लाज्मिड pBeloBAC1134 एक सख्ती से नियंत्रित प्रतिकृति है, सेल प्रति प्लाज्मिड के एक या दो प्रतियां रखते हुए, जो विषाक्तता को कम करता है और अस्थिर सीडीएए के बैक्टीरिया में स्थिर रखरखाव की अनुमति देता है। ii) बीएसी प्लाज्मिड का प्रचार और संशोधन लगभग पारंपरिक प्लाज्मिड के समान है, बड़े आकार के बीएसी-डीएनए टुकड़ों और कम प्रतिलिपि प्लाज्मिड में हेरफेर करने के लिए इस प्रोटोकॉल में वर्णित मामूली संशोधनों पर विचार करते हुए। विशेष रूप से, बीएसी cDNA क्लोन भी लाल पुनर्संयोजन प्रणाली42,43,44 का उपयोग कर के समजात पुनर्संयोजन द्वारा ई कोलाई में संशोधित किया जा सकता है ) CMV प्रमोटर के उपयोग की अनुमति देता है छाया हुआ जेडआईकेवी vRNA के intracellular अभिव्यक्ति और एक इन विट्रो प्रतिलेखन कदम की आवश्यकता के बिना संक्रामक वायरस की वसूली. iv) संक्रामक आरजेडआईवीबीएसईवी बीएसी सीडीएनए क्लोन के साथ अतिसंवेदनशील कोशिकाओं (उदा., वेरो) के प्रत्यक्ष संक्रमण के बाद उत्पन्न होता है। चूंकि स्तनधारी कोशिकाओं में डीएनए transfection आरएनए transfection की तुलना में अधिक कुशल है, बीएसी दृष्टिकोण के साथ वायरस वसूली दक्षता आरएनए प्रतिलिपि का उपयोग कर मनाया है कि अधिक से अधिक है, संस्कृति कोशिकाओं में मार्ग की संख्या को कम करने के लिए एक वायरल स्टॉक उत्पन्न करने के लिए और, फलस्वरूप, सेल संस्कृति अनुकूलन द्वारा अवांछित उत्परिवर्तनों की शुरूआत को सीमित.
अंत में, बीएसी दृष्टिकोण की क्षमता इस विधि के सफल उपयोग द्वारा समर्थित है (थोड़ा संशोधनों के साथ) डेंगू वायरस36सहित अन्य flaviviruses के संक्रामक cDNA क्लोन इंजीनियर करने के लिए, और में उच्च प्रभाव के कई कोरोनावायरस मानव और पशु स्वास्थ्य, जैसे ट्रांसमिसिबल गैस्ट्रोएंटराइटिस कोरोनावायरस37 (TGEV), बिल्ली संक्रामक पेरिटनिटिस वायरस38 (एफआईवी), मानव कोरोनावायरस OC4339 (HCoV-OC43), गंभीर श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस40 (SARS-CoV), और मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस41 (MERS-CoV), दूसरों के बीच.
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल में, वहाँ दो महत्वपूर्ण कदम है कि विचार किया जाना चाहिए रहे हैं. एक महत्वपूर्ण विचार वायरल जीनोम है कि बीएसी प्लाज्मिड में अनुपस्थित रहे हैं में उपयुक्त अद्वितीय प्रतिबंध साइटों की पहचान है. यदि कोई पर्याप्त प्रतिबंध साइटों उपलब्ध हैं, नए प्रतिबंध साइटों मूक न्यूक्लिओटाइड उत्परिवर्तनों की शुरूआत से क्लोनिंग डिजाइन के दौरान उत्पन्न किया जा सकता है. एक अन्य महत्वपूर्ण मुद्दा यह है कि बीएसी प्लाज्मिड प्रति सेल केवल एक या दो प्रतियों में मौजूद हैं, और इसलिए, बैक्टीरियल जीनोमिक डीएनए के उच्च संदूषण के साथ बीएसी प्लाज्मिड की कम पैदावार उच्च के लिए डिज़ाइन किए गए मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त की जाती है- और मध्यम प्रतिलिपि संख्या प्लाज्मिड. इस संभावित समस्या को आसानी से बड़ी संस्कृति की मात्रा का उपयोग कर दूर है और एक वाणिज्यिक किट विशेष रूप से बीएसी शुद्धि के लिए विकसित के साथ बीएसी प्लाज्मिड शुद्ध.
संक्षेप में, हम एक बीएसी है कि स्थिर और पूरी तरह कार्यात्मक संक्रामक cDNA क्लोन अन्य सकारात्मक-संक्षिप्त आरएनए वायरस के उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के उपयोग के आधार पर एक शक्तिशाली ]iKV रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण विकसित किया है इन के जीव विज्ञान के अध्ययन की सुविधा के लिए वायरस और टीकों के विकास और /
The authors have nothing to disclose.
लेखकों को बीएसी cDNA क्लोन पीढ़ी और Snezhana Dimitrova वीडियो तैयार करने के साथ मदद करने के लिए में उसकी तकनीकी सहायता के लिए कार्ला Gemez शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इस काम के भाग में स्पेन के अर्थव्यवस्था और प्रतिस्पर्धा मंत्रालय (MINCO, अनुदान संख्या BFU2016-79127-आर) F.A.T. और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (NIH, अनुदान संख्या 1R21AI120500) से एल.एम.एस.
1. Molecular Biology Reagents | |||
Afe I | New England BioLabs | R0652S | 10,000 units/mL |
AmpliTaq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) | N8080161 | 5,000 Units/mL |
ApaL I | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/mL |
Asc I | New England BioLabs | R0558S | 10,000 units/mL |
BamH I | New England BioLabs | R0136S | 10,000 units/mL |
BstB I | New England BioLabs | R0519S | 20,000 units/mL |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
ElectroMAX DH10B Cells | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 18290015 | Electocompetent DH10B cells |
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm | Bio-Rad | 165-2086 | |
Ethanol | Merck | 100983 | Flamable |
Isopropanol | Merck | 109634 | Flamable |
Large-Construct Kit (10) | QIAGEN | 12462 | For high-purity BAC preparation |
LB Broth | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 12780029 | Can be homemade as well |
LB with Agar | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 22700041 | Can be homemade as well |
Methanol | Merck | 106009 | Flamable |
Mlu I | New England BioLabs | R0198S | 10,000 units/mL |
Oligonucleotides | IDT | N/A | |
Plasmid pBeloBAC11 | New England BioLabs | ER2420S (E4154S) | |
Plasmid Midi Kit (25) | QIAGEN | 12143 | For midle-scale preparation of BAC plasmids |
Pml I | New England BioLabs | R0532S | 20,000 units/mL |
Polypropylene tubes (10 mL) | DeltaLab | 175724 | Other commercial sources are acceptable |
QIAEX II Gel Extraction Kit (150) | QIAGEN | 20021 | Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb |
Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/mL |
SOC Medium | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 15544034 | Can be homemade as well |
Synthesis of cDNA fragments | Bio Basic | N/A | |
T4 DNA Ligase | Sigma-Aldrich (Roche) | 10481220001 | 1,000 units/mL |
2. Cell Culture Reagents | |||
6-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 140675 | |
12-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 150628 | |
24-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 142485 | |
Agar Noble | VWR | 214230 | |
Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibody | Varies | N/A | |
Biotinylated Anti-Mouse Secondary Antibody | Varies | N/A | |
Cell Culture Dishes (100×21 mm) | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 172931 | |
Conical Tubes (15 mL) | VWR | 525-0150 | |
Conical Tubes (50 mL) | VWR | 525-0155 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Toxic and carcinogenic |
DEAE-Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
DMEM | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 11995065 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific (HyClone)) | SV30160.03 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Toxic and carcinogenic |
L-Glutamine | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 25030081 | |
Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 11668019 | Transfection reagent |
Nonessential amino acids | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 11140035 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 31985070 | Transfection medium |
Pan-flavivirus E protein mAb 4G2 | BEI Resources | NR-50327 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | Toxic and carcinogenic |
PBS | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 14190144 | |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 15140122 | |
ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | P10144 | |
Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories Inc | PK-4010 | Avidin/biotin-based peroxidase kit |
Vero Cells | ATCC | CCL-81 | |
ZIKV E Protein mAb 1176-56 | BioFront Technologies | BF-1176-56 | |
3. Equipment | |||
Agarose Gel Electrophoresis System | Bio-Rad | 1704468 | Other commercial sources are acceptable |
Class II Biosafety CO2 Cabinet | Varies | N/A | Other commercial sources are acceptable |
Desktop Refrigrated Centrifuge | Varies | N/A | |
Fluorescence Microscope | Varies | N/A | |
High-Speed Refrigrated Centrifuge | Varies | N/A | |
MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | Other machines are acceptable |
SimpliAmp Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) | A24811 | Other machines are acceptable |
Vortexer | Varies | N/A |