Isolamento delle particelle di lipoproteina dal tuorlo di uovo di pollo per lo studio dell'incorporazione di acido acido grasso patogeno batterico in fosfolipidi di membrana

Summary

Questo metodo fornisce un quadro per studiare l’incorporazione di acidi grassi esogeni da sorgenti ospiti complesse in membrane batteriche, in particolare Staphylococcus aureus. Per raggiungere questo obiettivo, vengono descritti i protocolli per l’arricchimento delle particelle di lipoproteina dal tuorlo di uova di gallina e la successiva profilazione dell’acido grasso di fosfatidi batterici che utilizzano la spettrometria di massa.

Abstract

Lo stafilococco aureus e altri patogeni positivi al Gram incorporano acidi grassi dall’ambiente nei fosfolipidi della membrana. Durante l’infezione, la maggior parte degli acidi grassi esogeni sono presenti all’interno delle particelle di lipoproteina dell’ospite. Permangono incertezze per quanto riguarda i serbatoi di acidi grassi ospiti e i meccanismi con cui i batteri estraggono gli acidi grassi dalle particelle di lipoproteina. In questo lavoro, descriviamo protocolli per l’arricchimento di particelle di lipoproteina a bassa densità (LDL) dal tuorlo d’uovo di gallina e determinando se i LDL fungono da serbatoi di acido grasso per S. aureus. Questo metodo sfrutta l’analisi lipidomica imparziale e gli LDL di pollo, un modello efficace ed economico per l’esplorazione delle interazioni tra LL e batteri. L’analisi dell’integrazione di S. aureus degli acidi grassi esogeni da LDL viene eseguita utilizzando spettrometria di massa ad alta risoluzione/accurata e spettrometria di massa tandem, consentendo la caratterizzazione della composizione dell’acido grasso del batterio identificazione imparziale e di nuove combinazioni di acidi grassi che sorgono nei lipidi della membrana batterica dopo l’esposizione a l’LDL. Queste tecniche avanzate di spettrometria di massa offrono una prospettiva senza precedenti di incorporazione di acidi grassi rivelando gli acidi grassi esogeni specifici incorporati nei fosforidi. I metodi qui descritti sono adattabili allo studio di altri patogeni batterici e fonti alternative di acidi grassi complessi.

Introduction

S. aureus resistente alla meticolina (MRSA) è la causa principale dell’infezione associata all’assistenza sanitaria e la resistenza agli antibiotici associata è una sfida clinica considerevole^1,2,3. Pertanto, lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche è una priorità assoluta. Una promettente strategia di trattamento per gli agenti patogeni Gram-positivi sta inibendo la sintesi degli acidi grassi, un requisito per la produzione di fosforidi di membrana che, in S. aureus, include fosfatidylglycerol (PG), lysyl-PG e cardiolipina⁴. Nei batteri, la produzione di acidi grassi avviene attraverso la via di sintesi degli acidi grassi II (FASII)⁵, che è notevolmente diversa dalla controparte eucatriste, rendendoI un obiettivo attraente per lo sviluppo antibiotico^5,6 . Gli inibitori del FASII si rivolgono principalmente a FabI, un enzima necessario per l’allungamento della catena del carbonio dell’acido grasso⁷. L’inibitore FabI triclosan è ampiamente utilizzato nei beni di consumo e medici^8,9. Ulteriori inibitori FabI sono in fase di sviluppo da diverse aziende farmaceutiche per il trattamento di S. aureus infezione^{10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26}. Tuttavia, molti patogeni Gram-positivi, tra cui S. aureus, sono in grado di raccogliere acidi grassi esogeni per la sintesi fosforolipidi, bypassando l’inibizione del FASII^27,28,29. Così, il potenziale clinico degli inibitori del FASII è discusso a causa di notevoli lacune nella nostra conoscenza delle fonti di acidi grassi ospiti e dei meccanismi con cui gli agenti patogeni estraggono gli acidi grassi dall’ospite^27,28. Per colmare queste lacune, abbiamo sviluppato un metodo di analisi lipidomica imparziale per monitorare l’incorporazione di acido grasso esogeno dalle particelle di lipoproteina in fosfolipidi della membrana di S. aureus.

Durante la sepsi, le particelle di lipoproteina ospite rappresentano una potenziale fonte di acidi grassi derivati dall’ospite all’interno della vascolatura, poiché la maggior parte degli acidi grassi ospiti sono associati alle particelle³⁰. Le lipoproteine sono costituite da un guscio idrofilo composto da fosfolipidi e proteine che racchiudono un nucleo idrofobico di trigliceridi e esteri di colesterolo³¹. Quattro classi principali di lipoproteine – chylomicron, lipoproteina a bassissima densità, lipoproteina ad alta densità e lipoproteina a bassa densità (LDL) – sono prodotte dall’ospite e funzionano come veicoli di trasporto lipidico, fornendo acidi grassi e colesterolo da e verso cellule ospiti attraverso la vascolatura. I LDL sono abbondanti in acidi grassi esterificati tra cui trigliceridi e tende di colesterolo^{31 .} Abbiamo già dimostrato che gli LDL umani altamente purificati sono una fonte vitale di acidi grassi esogeni per la sintesi di PG, fornendo così un meccanismo per il bypass dell’inibitore di FASII³². Purificanti LDL umani può essere tecnicamente impegnativo e richiede molto tempo, mentre le fonti commerciali di LDL umani purificati sono proibitivi da utilizzare su base di routine o per eseguire schermi batterici su larga scala. Per affrontare queste limitazioni, abbiamo modificato una procedura per l’arricchimento dei LDL dal tuorlo d’uovo di gallina, una ricca fonte di particelle di lipoproteina³³. Abbiamo utilizzato con successo spettrometria di massa ad alta risoluzione, ad alta risoluzione/accurata e spettrometria di massa tandem per monitorare l’incorporazione di acidi grassi derivati da LDL umani nella membrana di S. aureus³². A differenza dei metodi precedentemente riportati, questo approccio può quantificare i singoli isomeri di acidi grassi per ciascuno dei tre principali tipi di fosfolipidi stafilocchidi. L’acido oleico (18:1) è un acido grasso insaturi presente all’interno di tutte le particelle di lipoproteina ospite che è prontamente incorporato nei fosfolipidi S. aureus ^29,30,32. S. aureus non è in grado di sintesi di acido oleico²⁹; pertanto, la quantità di acido oleico incorporato al fosfolipidi desta la presenza di acidi grassi di origine lipoproteina ospite all’interno della membrana stafilocca²⁹. Queste specie di fosfolipidi possono essere identificate con il metodo di spettrometria di massa all’avanguardia descritto qui, offrendo una risoluzione senza precedenti della composizione della membrana di S. aureus coltivata in presenza di una fonte di acido grasso che probabilmente durante l’infezione.

Protocol

NOTA: Il seguente protocollo per l’arricchimento delle particelle LDL dal tuorlo d’uovo di gallina è derivato da Moussa et al. 200233. 1. Preparazione del tuorlo d’uovo di gallina per l’arricchimento delle particelle LDL Sanitizzare due grandi uova di gallina lavando le conchiglie con soluzione di etanolo del 70% e lasciare asciugare all’aria. Sanificare il separatore delle uova utilizzando una soluzione di etanolo 70% e lasciare asciugare all’aria….

Representative Results

Il protocollo per l’arricchimento di LDL dal tuorlo d’uovo di gallina è illustrato nella figura 1. Questo processo inizia diluindo il tuorlo d’uovo intero con la salina e separando i solidi del tuorlo d’uovo indicati come granuli dalla frazione solubile o plasma contenente i LDL (Figura 1)33. Il contenuto di LDL della frazione plasmatica è ulteriormente arricchito dalla precipitazione del kDa 30-40 dolla…

Discussion

S. aureus incorpora acidi grassi esogeni nei suoi fosfolipidi di membrana^27,32,43. La sintesi fosforalipidea utilizzando acidi grassi esogeni bypassa l’inibizione fasiLi ma altera anche le proprietà biofisiche della membrana^27,32,44. Mentre l’incorporazione di acidi grassi esogeni nei fosfolipidi di patogeni Gram-positivi è b…

Materials

Ammonium sulfate	Fisher	BP212R-1	≥99.5% pure
Cell culture incubator	Thermo	MaxQ 6000
Centrafuge	Thermo	75-217-420	Sorvall Legen XTR, rotor F14-6×250 LE
Costar assay plate	Corning	3788	96 well
Filter paper	Schleicher & Schuell	597
Large chicken egg	N/A	N/A	Common store bought egg
Microplate spectrophotometer	BioTek	Epoch 2
NaCl	Sigma	S9625
S. aureus strain AH1263	N/A	N/A	Provided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubing	Pierce	68700	7,000 MWCO
Tryptone	Becton, Dickison and Company	211705
0.5 mm zirconium oxide beads	Next Advance	ZROB05
Bullet Blender	Next Advance	BBX24B
Methanol (LC-MS grade)	Fisher	A4561
Chloroform (reagent grade)	Fisher	MCX10559
Isopropanol (LC-MS grade)	Fisher	A4611
Dimyristoyl phosphatidylcholine	Avanti Polar Lipids	850345C-25mg
Ammonium bicarbonate	Sigma	9830	≥99.5% pure
Ammonium formate	Sigma	70221-25G-F
Xcalibur software	Thermo Scientific	OPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer	Thermo Scientific		high resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLC	Agilent
SpeedVac Vacuum Concentrators	Thermo Scientific