शारीरिक रूप से आवेशित, पीएच-उत्तरदायी सिरना नैनोकणों के भौतिकोरासायनिक गुणों और बायोएक्टिविटी को तैयार करने और उनकी विशेषता बताने की विधियां प्रस्तुत की गई हैं । सफल सरना के लिए मापदंड जैसे आकार, आकारिकी, सतह आवेश, सिरना लोडिंग, और जीन साइलैंसिंग पर चर्चा की जाती है ।
एक लक्षित आणविक चिकित्सा के रूप में siRNA की सफलता विकृति विज्ञान के ऊतकों के भीतर कोशिकाओं को अपने कुशल cytosolic प्रसव पर निर्भर है । सिरना के साथ पहले ‘ undruggable ‘ यकृत रोग लक्ष्य के इलाज के लिए नैदानिक सफलता हासिल की गई है । हालांकि, कुशल ट्यूमर सरना प्रसव के लिए अतिरिक्त फार्माकोकाटिक डिजाइन विचार करना आवश्यक है, जिसमें लंबे परिसंचरण समय, निकासी अंगों की चोरी (जैसे, यकृत और गुर्दे), और ट्यूमर प्रवेश और प्रतिधारण । यहाँ, हम, विशेष रूप से गैर-यकृत ऊतकों जैसे ट्यूमर के लिए, कुशल सरना प्रसव के लिए अभिकल्पित पॉलीमेरिक नैनोकणों की तैयारी और इन विट्रो फिजिकोकेमिकल/जैविकीय विशेषताओं का वर्णन करते हैं । सिरना नैनोकणों को सिलना और डिब्लॉक कोपॉलीमर पॉली (एथिलीन ग्लाइकोल-बी-(डाइमिथाइलइलिमिनो) एथिल मेथिक्रिलेट-सह-ब्यूटिल मेथैक्रिलेट]) (पीईजी-डीबी) के इलेक्ट्रोस्टेटिक संकुलन द्वारा पॉलीआयन कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए तैयार किया जाता है ( पॉलीप्लेज) जहां सिरना पॉलीप्लेक्स कोर के भीतर तनहा होता है और एक हाइड्रोफिलिक, न्यूट्रिन चार्ज कोरोना के रूप में पेग बनाता है । इसके अलावा, डीबी ब्लॉक endolysosomal मार्ग acidify (< पीएच ६.८) के पुटिकाओं के रूप में झिल्ली-lytic हो जाता है, अंत: सोमीय बच और सिलना के cytosolic वितरण ट्रिगर । इस तरह के आकार, सतह चार्ज, कण आकृति विज्ञान, और sirna लदान के रूप में sirna नैनोकणों की भौतिक विशेषताओं की विशेषता के लिए तरीके वर्णित हैं । सिरना नैनोकणों की जैव सक्रियता को एक तीव्र और उच्च थ्रूपुट जीन सिलैंसिंग परख में एक मॉडल जीन के रूप में luciferase का उपयोग करके मापा जाता है । डिजाइन जो इन प्रारंभिक परीक्षणों के पास (जैसे कि खूंटी-डीबी-आधारित पॉलीप्लेन्स) ट्यूमर या पैथोलॉजी के अन्य साइटों के लिए सिरना की डिलीवरी का आकलन करने के लिए पूर्व नैदानिक पशु अध्ययन करने के लिए अनुवाद के लिए उपयुक्त माना जाता है.
क्योंकि सिनास mrna दृश्यों से प्रोटीन के अनुवाद को रोकते हैं, वे सैद्धांतिक रूप से दवा सभी ज्ञात विकृतियों1,2,3,4,5के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । तथापि, दवा में सिरना का उपयोग व्यापक रूप से गरीब sirna अणुओं के फार्माकोकानेटिक प्रोफ़ाइल द्वारा सीमित है6,7. जब नसों में इंजेक्शन, सिरनास तेजी से गुर्दे के माध्यम से मंजूरी दे दी है और/ अपने बड़े आकार और ऋणात्मक आवेश के कारण, सिरना कोशिकाओं में प्रवेश नहीं कर सकता या फिर आरएनए-प्रेरित साइलैंसिंग परिसर (RISC) का उपयोग करने के लिए एंडोलीसोसोमल मार्ग से बच नहीं पाता है जो सायकोसोल10,11,12, १३। इस प्रकार, व्यापक प्रयास ने सरना सुपुर्दगी रणनीतियों के डिजाइन और कार्यान्वयन पर ध्यान केन्द्रितकिया है । यह प्रयास काफी हद तक लिपिड के विकास पर ध्यान केंद्रित किया है-और बहुलक आधारित नैनोकणों जो पैकेज sirna, यह मंजूरी और vivo में गिरावट से बचाने के लिए, और सेलुलर तेज और अंतर्दैहिक एस्केप के माध्यम से शुरू ionizable, धनायनी amine समूह । कई पूर्व नैदानिक सफलताओं की सूचना दी है और सबसे हाल ही में, पहली नैदानिक सफलता नैनोकणों के लिए रिपोर्ट किया गया है आधारित यकृत siRNA प्रसव के लिए वंशानुगत transthyretin-मध्यस्थता (hATTR) amyloidosis के इलाज के लिए15।
कैंसर के कारण कई जीन हैं जो वर्तमान में पारंपरिक फार्माकोलॉजी (यानी, छोटे अणु की दवाओं) द्वारा “अनड्रग्ड” होते हैं, जो16कैंसर के इलाज के लिए पॉलीमेरिक सिरना नैनोकणों (Si-एनपीएस) के डिजाइन को प्रेरित करते हैं । हालांकि, वहां डिजाइन मापदंडों का एक अलग सेट है कि गैर के लिए विचार किया जाना चाहिए-यकृत siRNA वितरण कर रहे हैं । वितरण प्रणाली polyplex जो प्रणालीगत संचलन17,18,19के भीतर समूहन कारणों के धनायनी प्रभारी ढाल चाहिए । ट्यूमर के वितरण के लिए, विशेष रूप से, si-NP स्थिरता लंबे संचलन प्रदान करना और इस तरह बढ़ाया पारगम्यता और प्रतिधारण (epr) प्रभाव के माध्यम से ट्यूमर के भीतर वृद्धि संचय के लिए आवश्यक है20,21. इसके अलावा, सी पर नियंत्रण-NP आकार केवल नैनोकणों के बाद से आवश्यक है लगभग 20-२०० एनएम व्यास आकार का लाभ उठाने EPR22में, और छोटे सी-एनपीएस (~ 20-५० एनएम व्यास) प्रदर्शन में सुधार ट्यूमर प्रवेश पर बड़े आकार नैनोकणों और माइक्रोकणों23।
नसों में प्रशासन के बाद सिरना के प्रणालीगत ट्यूमर प्रसव के लिए इन अतिरिक्त डिजाइन बाधाओं को दूर करने के लिए, तटस्थ-आवेशित, पीएच-उत्तरदायी si-एनपीएस विकसित किया गया है (चित्रा 1)24. ये सी-एनपीएस पेग्यलित है, या सबसे हाल ही में, Zwitterionated25, तटस्थ सतह चार्ज और प्रोटीन अधिशोषण के लिए प्रतिरोध और संचलन में opsonization के लिए । वे केवल धनायनी चरित्र पर intracellular वितरण ड्राइव करने के लिए भरोसा नहीं कर सकते क्योंकि, अत्यंत कुशल endosomal भागने शक्तिशाली जीन को साइलैंसिंग प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । तदनुसार, इन पै-एनपीएस का मुख्य भाग एक अत्यधिक अंतर्सोपायिक क्रोड से बना होता है जो कोशिकाबाह्य पीएच (७.४) में निष्क्रिय होता है, लेकिन जो अंत: सोसोमीय मार्ग की एसिडिफाइड स्थितियों में स्विच-जैसे तरीके से ट्रिगर होता है [पीएच ६.८ (आरंभिक अंतःकाय)-५.० ( लइसोसोम्स)] । अंत में, पै-एनपीएस के क्रोड के भीतर धनायनिक और हाइड्रोफोबिक सामग्री का मिश्रण स्थिरवैद्युत और वान्डर-रवाल्स स्थिरीकरण बल प्रदान करता है, जो मात्र प्रमात्रा प्रणालियों की तुलना में रक्त में पै-एनपीएस की स्थिरता को बेहतर करता है ।
एक अपेक्षाकृत सरल डिजाइन में कई कार्यों के एकीकरण प्रतिवर्ती इसके अलावा का उपयोग कर संभव है-विखंडन श्रृंखला हस्तांतरण (बेड़ा) नियंत्रित बहुलकीकरण जटिल वास्तुकला और सटीक संरचना के साथ पॉलिमर का उत्पादन करने के लिए । तटस्थ सतह प्रभार, पीएच जवाबदेही, और एनपी स्थिरता के साथ एसआई-एनपीएस का उत्पादन करने के लिए, बेड़ा (एथिलीन glycol-b-(dimethylamino) एथिल methacrylate-सह-butyl METHACRYLATE) (पेग-DB) के संश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है । चित्र 1a) । खूंटी-डीबी, एक पेग कोरोना और डीबी/सिरना कोर (चित्र 1बी) के साथ सी-एनपीएस बनाने, सिरना के साथ इलेक्ट्रोटिकली complexed है । खूंटी के रूप में एक अक्रिय, उदासीनतापूर्वक-चार्ज हाइड्रोफिलिक परत पर si-NP कोरोना । डीबी ब्लॉक के एक 50:50 मोलर अनुपात के होते हैं 2-(dimethylamino) एथिल मेथिक्रिलेट (DMAEMA) और butyl methacrylate (BMA). धनायनिक दमामा इलेक्ट्रोस्टैटिकली परिसरों नकारात्मक-आरोप siRNA । BMA स्वयं-NP कोर के भीतर वान डेर Waals बातचीत से एसोसिएट्स, बढ़ती एनपी स्थिरता । DB बहुलक ब्लॉक करने के लिए एक साथ, DMAEMA और BMA पीएच पर निर्भर लिपिड बिलेयर-lytic व्यवहार प्रदान करते हैं । Extracellular पीएच पर, DB ब्लॉक si-NP कोर करने के लिए तनहा है और लिपिड bilayers के लिए निष्क्रिय है । अम्लीय परिस्थितियों में, जैसे कि एंडोसोसोमल पथ के भीतर, डीबी ब्लॉक के भीतर ionizable dmaema प्रोटन स्पंज प्रभाव, जहां endosomal बफरिंग परासरणी सूजन और टूटना करने के लिए सुराग की सुविधा26। इसके अतिरिक्त, डीबी ब्लॉक के भीतर जलविरागी bma moieties में सक्रिय रूप से और lyse लिपिड bilayers, शक्तिशाली endosomolysis में जिसके परिणामस्वरूप एकीकृत । इस प्रकार, सिरना में सी-एनपीएस बनाने के लिए खूंटी-डीबी का निर्माण किया जाता है जो कि न्यूली-आवेशित तथा निष्कर्षी पीएच पर अत्यधिक स्थिर होता है, लेकिन जो अम्लीय पीएच पर लिपिड बियर्स को बाधित करता है, जिससे सरना पेलोड का कोशिकाद्रव्य वितरण सुनिश्चित होता है ।
इसके साथ-साथ, खूंटी-डीबी से सी-एनपीएस का निर्माण करने के लिए प्रायोगिक प्रक्रियाएं वर्णित हैं । (क) में दिया गया है और इस पर विचार किया जाता है । आदेश में तेजी से si-एनपी bioactivity का आकलन करने के लिए, luciferase पछाडडाउन अध्ययन के लिए एक मॉडल जीन के रूप में प्रयोग किया जाता है. जुगनू Luciferase27जुगनू की ‘ चमक ‘ के लिए जिंमेदार प्रोटीन है । तदनुसार, स्तनधारी कोशिकाओं जुगनू luciferase जीन के साथ transfected एक बायोल्युमिनेसेंट ‘ चमक ‘ कि luciferase अभिव्यक्ति के स्तर की मात्रा करने के लिए एक luminometer का उपयोग कर कब्जा किया जा सकता का उत्पादन । यहाँ, हम सिल्यूफेरेज का उपयोग सी-एनपीएस के जैवसक्रियता का आकलन लूसीफेरेज के विरुद्ध सिरना को प्रदान करके और ल्यूसिफेरेज-व्यक्त कोशिकाओं में जैव-संदीप्ति में तदनुरूपी कमी की मात्रा का आंकलन करने के लिए करते हैं जो कि एक तले हुए सिरना प्राप्त करते हैं ।
यहां वर्णित एसआई-एनपीएस का संबंध इलेक्ट्रोस्टेटिक एसोसिएशन ऑफ एनीमोनिक सिरना और धनायनी पॉलीमर्स में पॉलीआयन कॉम्प्लेक्स (पॉलीप्लेज) से होता है । स्थिरवैद्युत संकुलन सिरना और खूंटी-डीबी पॉलीमर्स के…
The authors have nothing to disclose.
लेखक डीआरएस के आभारी हैं । क्रेग Duvall और रेबेका इस अनुसंधान के संचालन के लिए डेटा और प्रयोगशाला संसाधनों तक पहुंच के लिए कुक । लेखक Nanoscale विज्ञान और इंजीनियरिंग के लिए Vanderbilt संस्थान (VINSE) के लिए आभारी है DLS और TEM (NSF EPS १००४०८३) उपकरणों के लिए उपयोग । लेखकों स्नातक अनुसंधान फैलोशिप कार्यक्रम (NSF # 1445197) का समर्थन करने के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन के लिए आभारी हैं । लेखक वित्तीय सहायता (NIH R01 EB019409) के लिए स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के लिए आभारी हैं । लेखक रक्षा विभाग के लिए आभारी है कांग्रेसवादी वित्तीय सहायता (DOD CDMRP OR130302) के लिए चिकित्सा अनुसंधान कार्यक्रम का निर्देशन किया ।
0.45 mm pore-size syringe filters | Thermo Fisher Scientific | F25133 | 17 mm diameter, PTFE membrane |
0-14 pH test strips | Millipore Sigma | P4786 | |
10x TAE buffer | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | AM9869 | |
6-7.7 pH test strips | Millipore Sigma | P3536 | |
96-well black walled plates | Corning | 3603 | Tissue-culture treated |
Agarose Powder | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 16500 | |
Citric acid monohydrate | Millipore Sigma | C1909 | |
dibasic sodium phosphate dihydrate | Millipore Sigma | 71643 | |
D-luciferin | Thermo Fisher Scientific | 88294 | Monopotassium Salt |
DMEM | Gibco | 11995065 | High glucose and pyruvate |
Ethanol | Millipore Sigma | 459836 | |
ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 15585011 | |
FBS | Gibco | 26140079 | |
loading dye | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | R0611 | |
Luciferase siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases |
MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells | GenTarget Inc | SC059-Bsd | Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity |
monobasic sodium phosphate monohydrate | Millipore Sigma | S9638 | |
Scarmbled siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases |
square polystyrene cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | 4.5 mL capacity |
TEM grids | Ted Pella, Inc. | 1GC50 | PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper |
Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804 | |
uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 |