Nós convertemos com sucesso o ensaio padrão do protocolo da amplificação da repetição do telomere (armadilha) a ser empregado em reações Chain digitais do polymerase da gota. Este novo ensaio, chamado ddTRAP, é mais sensível e quantitativo, permitindo uma melhor detecção e análise estatística da atividade de telomerase dentro de várias células humanas.
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Artigo de método
ARMADILHA digital da gota (ddTRAP): adaptação do protocolo da amplificação da repetição de telomere à reacção em cadeia da polimerase de droplet Digitas
Neste artigo
Resumo
Resumo
O protocolo da amplificação da repetição do telomere (armadilha) é o ensaio o mais extensamente usado para detectar a atividade do telomerase dentro de um dado uma amostra. A reacção em cadeia do polymerase (PCR)-baseou o método permite medidas robustas da atividade de enzima da maioria de lysates da pilha. A armadilha baseada em gel com primers com rótulo fluorescente limita a taxa de transferência da amostra, e a capacidade de detectar diferenças nas amostras é restrita a duas vezes ou mais alterações na atividade enzimática. A armadilha digital da gota, ddTRAP, é uma aproximação altamente sensível que seja modificada do ensaio tradicional da armadilha, permitindo que o usuário realize uma análise robusta em 96 amostras por a execução e obtenha a quantificação absoluta do ADN (produtos da extensão do telomerase ) de entrada dentro de cada PCR. Conseqüentemente, o ensaio recentemente desenvolvido de ddTRAP supera as limitações do ensaio tradicional gel-baseado da armadilha e fornece uma aproximação mais eficiente, exata, e quantitativa para medir a atividade do telomerase dentro do laboratório e das configurações clínicas.
Introdução
Telômeros são complexos de proteína de DNA dinâmicos nas extremidades dos cromossomas lineares. Os telômeros humanos são compostos de uma matriz de 5 '-TTAGGGn repetições hexamérica que variam de comprimento entre 12 – 15 kilobases (KB) ao nascimento1. A telomerase humana, a enzima ribonucleoproteína que mantém os telómeros, foi identificada pela primeira vez em lisados de células HeLa (linha celular cancerosa)2. Juntos, telómeros e telomerase desempenham um papel importante em um espectro de processos biológicos, como proteção do genoma, regulação gênica e imortalidade de células cancerosas3....
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Protocolo
1. preparação e armazenamento do tampão
- Prepare 50 ml de 1x estoque RNase-/DNase-Free NP-40 lysis buffer (10 mm Tris-HCl [pH 8,0], 1 mm MgCl1,2mm etilenodiaminotetracético ácido (EDTA), 1% [VOL/VOL] NP-40, 10% [VOL/VOL] glicerol, 150 mm NaCl, 5 mm β-Mercaptoetanol e 0,1 mm 4- cloridrato de fluoreto de benzenesulfonilo (AEBSF)). Este tampão pode ser aliquotado e armazenado em-20 ° c para o uso futuro. Evite ciclos de congelamento/descongelação para obter uma lise ideal das células.
- Prepare 50 mL de 10x estoque RNase-/DNase-free buffer de extensão de armadilha (200 mM Tris-HCl [pH 8,0], 15 mM MgCl2, 630 mm kcl, 0,5% [VOL/VOL] Tw....
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Resultados
Usando o ddtrap, a atividade da telomerase foi medida em um painel da pilha que consiste nas seguintes linhas de pilha (Figura 1): cancro de pulmão da pilha CPNPC (H2882, H1299, Calu6, H920, A549, e H2887), cancro de pulmão pequeno da pilha (H82 e SHP77), e telomerase-negativo fibroblastos (BJ). 1 milhão pelotas de células foram lisadas em tampão NP-40, e as reações de extensão de telomerase foram realizadas em triplicatos biológicos. Um controle negativo com.......
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Discussão
A medida da atividade da telomerase é crítica a uma pletora de tópicos da pesquisa que incluem, mas não limitado a, cancro, biologia do telomere, envelhecimento, medicina regenerativa, e projeto estrutura-baseado da droga. Telomerase RNPs são de baixa abundância, mesmo em células cancerosas, fazendo a detecção e estudo desta enzima desafiador. Neste artigo, nós descrevemos os procedimentos passo a passo para o ensaio recentemente desenvolvido de ddTRAP para quantificar robustamente a atividade do telomerase nas pilhas. C.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de reconhecer fontes de financiamento dos institutos nacionais de saúde (NIH) (NCI-r00-CA197672-01A1). As linhas de câncer de pulmão de pequenas células (SHP77 e H82) foram um presente generoso dos Drs. John Minna e Adi Gazdar do UT Southwestern Medical Center.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | Livre de RNAse/DNAse |
| 1 M MgCl2 | Livre de Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | Livre de RNAse/DNAse |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Glicerol Ultrapuro | Invitrogen | 15514011 | Livre de RNAse/DNAse |
| fluoreto de fenilmetilsulfonil | Thermo Scientific | 36978 | Pó |
| 2-Mercaptoetanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Livre de Nuclease H20 | Ambion | AM9932 | Livre de RNAse/DNAse |
| 2,5 mM mistura dNTP | Thermo Scientific | R72501 | 2,5 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | livre de RNAse/DNAse |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0,5 M EGTA pH 8,0 | Fisher | 50-255-956 | livre de RNAse/DNAse |
| (TS) Tecnologia | de DNA integrada (IDT) | Primer personalizado (purificado por HPLC) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'ACX |
| (reverso) Primer | Tecnologia de DNA integrada (IDT) | Primer personalizado (purificado por HPLC) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3'Tubos |
| de grau PCR de paredes finas (250 ul) | USA Scientific | 1402-2900 | tiras, placas, tubos etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Placa de poço | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable folha de vedação térmica | Bio Rad | 1814040 | |
| Cartuchos do gerador de gotículas (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Óleo do gerador de gotículas | Bio Rad | 1863005 | |
| Junta do gerador de gotículas | Bio Rad | 1863009 | |
| Termociclador de 96 poços T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Seladora | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Leitor de gotículas e software Quantasoft | Bio Rad | 1864001 e 1864003 | |
| ddPCR Leitor de gotículas Óleo | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Pontas de pipeta filtradas sem nuclease | Thermo Científico | 10 ul, 20 ul, 200 ul e 1000 ul |
Referências
- Frenck, R. W. Jr, Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B.
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Reimpressões e permissões
