液滴数字 TRAP (ddTRAP): 对端粒重复放大协议的适应性, 以实现液滴数字聚合酶链反应
Summary
我们成功地转换了标准端粒重复扩增协议 (TRAP) 检测, 用于液滴数字聚合酶链反应。这种新的检测方法称为 ddTRAP, 更灵敏、更定量, 可以更好地检测和统计各种人体细胞内端粒酶活性。
Abstract
端粒重复扩增协议 (TRAP) 是检测给定样品中端粒酶活性的最广泛使用的检测方法。基于聚合酶链反应 (PCR) 的方法可以对大多数细胞裂解物的酶活性进行可靠的测量。具有荧光标记引物的凝胶为基的 trap 限制了样品的吞吐量, 检测样品差异的能力被限制为酶活性的两倍或更大的变化。液滴数字 TRAP, ddTRAP, 是一种高度敏感的方法, 已从传统的 TRAP 分析进行了改进, 使用户能够对每次运行的96个样本进行可靠的分析, 并获得 DNA (端粒酶延伸产品) 的绝对定量) 在每个 PCR 中输入。因此, 新开发的 ddTRAP 检测克服了传统的基于凝胶的 trap 检测方法的局限性, 为在实验室和临床环境中测量端粒酶活性提供了更有效、更准确和更定量的方法。
Introduction
端粒是线性染色体末端的动态 dna-蛋白质复合物。人类端粒由 5 ‘-ttagggn六角重复量组成, 其长度在出生时的长度为12–15千基 (kb) 1。人类端粒酶, 维持端粒的核糖核酸酶, 首次被鉴定在 HeLa 细胞裂解物 (癌细胞系)2中。端粒和端粒酶共同在基因组保护、基因调控和癌细胞死亡 3、4、5、6等一系列生物过程中发挥着重要作用。
人端粒酶主要由两个关键成分组成, 即端粒酶逆转录酶和端粒酶 RNA (分别为 hTERT 和 HTERT)。蛋白质亚基 hTERT 是端粒酶的催化活性逆转录酶成分。RNA 模板 hTERC 为端粒酶提供了扩展和/或维持端粒的模板。大多数人体组织没有可检测到的端粒酶活性。DNA 聚合酶无法扩展 DNA 滞后链的末端, 以及端粒酶的缺乏, 导致端粒在每轮细胞分裂后逐渐缩短。这些现象导致端粒缩短在大多数体细胞, 直到他们达到一个临界缩短的长度, 从而细胞进入复制衰老的状态。细胞的最大分裂次数是由其端粒长度决定的, 而这种细胞持续分裂被认为是为了防止进展到发生 7.癌细胞能够克服端粒诱导的复制衰老, 并通过利用端粒酶维持端粒继续增殖。大约90% 的癌症激活端粒酶, 使端粒酶活性在癌症检测和治疗中至关重要。
1990年代的发展有助于确定端粒酶的必要成分, 并用于测量各种正常和癌变的细胞和组织中的端粒酶。最初的基于凝胶的 PCR 检测方法使用放射性标记的 DNA 底物来检测端粒酶活性。2006年, 该方法被采用荧光标记的基板8,9进行了改编成非放射性形式。通过使用荧光标记的基板, 用户能够将端粒酶扩展产品可视化为凝胶上的条带, 使其暴露在正确的激发波长下。TRAP 检测方法的灵敏度及其检测粗细胞裂解物端粒酶活性的能力使其成为最广泛使用的端粒酶活性检测方法。然而, TRAP 检测有局限性。该分析是基于凝胶的, 因此很难在中等至高通量的研究中进行必要的复制, 因此, 很少进行适当的统计分析。此外, 基于凝胶的检测很难可靠地量化, 因为无法检测到样本间端粒酶活性的不到两倍的差异。克服这两个限制对于酶活性检测 (如 TRAP) 转移到临床或行业环境以检测患者样本或药物设计研究中的端粒酶活性至关重要。
数字 PCR 最初是在1999年开发的, 作为将 PCR 的指数和模拟性质转化为线性和数字检测10的一种手段。液滴数字 PCR (ddPCR) 是原始数字 PCR 方法的最新创新。液滴数字 PCR 是随着先进的微流体和水中油乳状液化学的出现而出现的, 能够可靠地产生稳定和同样大小的液滴。与基于凝胶甚至定量 PCR (qPCR) 不同, Ppcr 会产生输入材料的绝对定量。Dpcr 的关键是通过将样品分成液滴来产生 ~ 20, 000个单独的反应。在终点 PCR 之后, 液滴读取器以流动-柏树式的方式扫描每个液滴, 计数、施胶大小, 并记录每个液滴中是否存在荧光 (即每个液滴中没有或不存在 PCR 放大器)。然后, 利用泊松的分布, 根据正液滴与液滴总数的比率来估计输入分子。此数字表示每个 PCR 中输入分子数量的估计。此外, 在96孔板上进行了 Pdpcr, 并对其进行了分析, 使用户能够运行许多样品, 并执行生物和技术复制, 以便进行适当的统计分析。因此, 我们将 Dpcr 的强大定量和中等通量特性与 TRAP 检测方法结合起来, 开发了 ddPCR 检测11。本方法旨在为用户研究和有力地量化生物样本11,12的绝对端粒酶活性。DdTRAP 的灵敏度使其能够量化有限和珍贵样品中的端粒酶活性, 包括单细胞测量。此外, 使用者还可以研究端粒酶操作和药物的影响, 绝对定量小于两倍的变化 (约50% 差异)。DdTRAP 是 TRAP 检测技术向现代实验室实验和临床环境的数字化和高吞吐量过程的自然演变。
Protocol
Representative Results
Discussion
端粒酶活性的测量对于大量的研究主题至关重要, 包括但不限于癌症、端粒生物学、衰老、再生医学和基于结构的药物设计。端粒酶 RNPs 含量低, 即使在癌细胞中也是如此, 这使得这种酶的检测和研究具有挑战性。本文介绍了新开发的 ddTRAP 检测在细胞中对端粒酶活性进行有力量化的分步过程。通过将传统的端粒酶扩展反应与 Dpcr 相结合, 我们能够定量检测肺癌细胞中端粒酶活性 (端粒酶扩展产物)。…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
提交人感谢国家卫生研究院 (NIH) 的资金来源 (NCI-R00-C197672-01A1)。小细胞肺癌系 (SHP77 和 H82) 是来自 UT 西南医疗中心的 John Minna 博士和 Adi Gazdar 博士的慷慨礼物。
Materials
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
Referências
- Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell. 59 (3), 521-529 (1989).
- de Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Role of telomeres and telomerase in cancer. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).
- Kim, W., Shay, J. W. Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD). Differentiation. 99, 1-9 (2018).
- Robin, J. D., et al. Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances. Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase. Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).
- Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Enhanced detection of human telomerase activity. DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).
- Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol. Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).
- Huang, E. E., et al. The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation. Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).
- Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity. Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).
