Druppel digitale val (ddTRAP): aanpassing van de Telomere Herhaal versterking protocol aan druppel digitale polymerase kettingreactie
Summary
We hebben met succes omgezet de standaard Telomere REPEAT versterking Protocol (TRAP) assay te worden gebruikt in druppel digitale polymerase chain reacties. Deze nieuwe Assay, genaamd ddTRAP, is gevoeliger en kwantitatieve, waardoor een betere opsporing en statistische analyse van telomerase activiteit binnen verschillende menselijke cellen.
Abstract
De Telomere REPEAT versterking Protocol (TRAP) is de meest gebruikte assay om telomerase activiteit te detecteren binnen een gegeven een monster. De polymerase kettingreactie (PCR)-gebaseerde methode staat voor robuuste metingen van enzymactiviteit van de meeste cel lysaten toe. De op gel-gebaseerde val met fluorescently geëtiketteerde inleidingen beperkt steekproef productie, en de capaciteit om verschillen in steekproeven te ontdekken is beperkt tot twee vouwen of grotere veranderingen in enzymactiviteit. De druppel digitale val, ddTRAP, is een zeer gevoelige benadering die is gewijzigd van de traditionele val Assay, waardoor de gebruiker een robuuste analyse uit te voeren op 96 monsters per run en het verkrijgen van absolute kwantificering van het DNA (telomerase extension producten ) input binnen elke PCR. Daarom is de nieuw ontwikkelde ddTRAP assay overwint de beperkingen van de traditionele gel-based TRAP assay en biedt een meer efficiënte, accurate en kwantitatieve benadering van het meten van telomerase activiteit binnen laboratorium en klinische instellingen.
Introduction
Telomeren zijn dynamische DNA-eiwitcomplexen aan de uiteinden van lineaire chromosomen. Menselijke telomeren zijn samengesteld uit een array van 5 ‘-TTAGGGn hexameren herhalingen die variëren in lengte tussen 12-15 kilobases (KB) bij de geboorte1. Human telomerase, de ribonucleoproteã enzym dat de telomeren handhaaft, werd voor het eerst geïdentificeerd in HeLa cel lysaten (kanker Cell line)2. Samen spelen telomeren en telomerase een belangrijke rol in een spectrum van biologische processen zoals de bescherming van het genoom, gen regulatie, en kanker cel onsterfelijkheid3,4,5,6.
Menselijke telomerase bestaat hoofdzakelijk uit twee belangrijke componenten, namelijk telomerase reverse transcriptase en telomerase RNA (respectievelijk hTERT en hTERC). De eiwit subeenheid, hTERT, is de katalytisch actieve omgekeerde transcriptase component van het telomerase enzym. De RNA template, hTERC, biedt telomerase met de sjabloon uit te breiden en/of te handhaven telomeren. De meeste menselijke somatische weefsels hebben geen detecteerbare telomerase activiteit. Het onvermogen van de polymerase van DNA om het eind van de achtergebleven bundel van DNA samen met het gebrek aan telomerase te verlengen leidt tot het progressieve verkorten van telomeren na elke ronde van cellulaire afdeling. Deze fenomenen leiden tot Telomere verkorting in de meeste somatische cellen tot zij een kritisch verkorte lengte bereiken, waardoor de cellen een staat van replicerende senescentie ingaan. Het maximale aantal keren dat een cel kan verdelen wordt gedicteerd door zijn Telomere lengte en dit blok aan voortdurende celdeling wordt gedacht om progressie te voorkomen tot oncogenese7. Kankercellen zijn in staat om Telomere-geïnduceerde replicerende senescentie te overwinnen en te blijven vermenigvuldigen door gebruik te maken van telomerase om hun telomeren te handhaven. Ongeveer 90% van de kankers te activeren telomerase, waardoor telomerase activiteit kritisch belangrijk in zowel de opsporing van kanker en behandeling.
De ontwikkeling van de val assay in de jaren 1990 was instrumenteel in de identificatie van de noodzakelijke componenten van het telomerase enzym, evenals voor de meting van telomerase in een breed scala van cellen en weefsels, zowel normaal als kanker. De originele op gel-gebaseerde PCR assay gebruikte radioactief geëtiketteerde de substraten van DNA om telomerase activiteit te ontdekken. In 2006, werd de analyse aangepast in een niet-radioactieve vorm gebruikend fluorescerend geëtiketteerde substraten8,9. Door het gebruik van fluorescerende geëtiketteerde substraten, gebruikers in staat waren om de telomerase uitbreiding producten te visualiseren als bands op een gel door het blootstellen aan de juiste excitatie golflengte. De gevoeligheid van de val assay en de mogelijkheid om telomerase activiteit op te sporen in ruwe cel lysaten heeft deze assay de meest gebruikte methode voor telomerase activiteit detectie. Echter, de val assay heeft beperkingen. De assay is gel-based, waardoor het moeilijk is om de nodige replica’s uit te voeren in matige tot high-throughput studies, en dus een goede statistische analyse is zelden bereikt. Bovendien is de gel-based assay moeilijk te kwantificeren betrouwbaar te wijten aan het onvermogen van het opsporen van minder dan tweeledige verschillen in telomerase activiteit tussen de monsters. Het overwinnen van deze twee beperkingen is van cruciaal belang voor enzymatische activiteit assays zoals de val te verhuizen naar klinische of industrie-instellingen voor de opsporing van telomerase activiteit in de patiënt monsters of drug design studies.
Digitale PCR werd aanvankelijk ontwikkeld in 1999 als middel om de exponentiële en analoge aard van PCR in een lineaire en digitale analyse10om te zetten. De digitale PCR van het druppeltje (ddPCR) is de recentste innovatie van de originele digitale PCR methodologie. De digitale PCR van het druppeltje kwam over met de komst van geavanceerde microfluidics en olie-in-water emulsie chemie om stabiele en even grote druppeltjes betrouwbaar te produceren. In tegenstelling tot gel-based en zelfs kwantitatieve PCR (qPCR), ddPCR genereert absolute kwantificering van het input materiaal. De sleutel tot ddPCR is de generatie van ~ 20.000 individuele reacties door het verdelen van steekproeven in druppeltjes. Na eind-punt PCR, scant de druppel lezer elke druppel in een cytometer-als manier, het tellen, het rangschikken, en registrerend de aanwezigheid of de afwezigheid van fluorescentie in elke individuele druppel (d.w.z., afwezigheid of aanwezigheid van PCR amplicons in elke druppel). Dan, met behulp van Poisson de distributie, input moleculen worden geschat op basis van de verhouding van de positieve druppels op het totale aantal druppels. Dit aantal vertegenwoordigt een raming van het aantal input molecules in elke PCR. Bovendien wordt ddPCR uitgevoerd en geanalyseerd op een 96-well plaat die het mogelijk maakt de gebruiker om vele monsters te draaien, evenals het uitvoeren van biologische en technische repliceert voor een goede statistische analyse. Als gevolg daarvan hebben we gecombineerd de krachtige kwantificering en matige doorvoersnelheid aard van ddPCR met de val assay om de ddTRAP assay11te ontwikkelen. Deze analyse is ontworpen voor gebruikers om te studeren en robuust te kwantificeren absolute telomerase activiteit van biologische monsters11,12. De gevoeligheid van de ddTRAP maakt het mogelijk de kwantificering van telomerase activiteit van beperkte en kostbare monsters, met inbegrip van single-cell metingen. Voorts kunnen de gebruikers de gevolgen van telomerase manipulaties en/of drugs met absolute kwantificatie van minder dan dubbele veranderingen (~ 50% verschillen) ook bestuderen. De ddTRAP is de natuurlijke evolutie van de val assay in de digitale en hogere doorvoersnelheid aard van de moderne laboratoriumexperimenten en klinische instellingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meting van telomerase activiteit is essentieel voor een overvloed van onderzoek onderwerpen met inbegrip van, maar niet beperkt tot, kanker, Telomere biologie, het verouderen, regeneratieve geneeskunde, en structuur-gebaseerd drug ontwerp. Telomerase RNPs zijn laag overvloedig, zelfs in kankercellen, het maken van de opsporing en studie van dit enzym uitdagend. In deze paper, beschreven we de stap-voor-stap procedures voor de nieuw ontwikkelde ddTRAP assay om robuust te kwantificeren telomerase activiteit in de cellen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zouden de financieringsbronnen van de nationale instituten van gezondheid (NIH) (NCI-R00-CA197672-01A1) willen erkennen. Kleine cel longkanker lijnen (SHP77 en H82) waren een royale geschenk van Drs. John Minna en ADI Gazdar van de UT Southwestern Medical Center.
Materials
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
Referências
- Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell. 59 (3), 521-529 (1989).
- de Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Role of telomeres and telomerase in cancer. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).
- Kim, W., Shay, J. W. Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD). Differentiation. 99, 1-9 (2018).
- Robin, J. D., et al. Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances. Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase. Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).
- Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Enhanced detection of human telomerase activity. DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).
- Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol. Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).
- Huang, E. E., et al. The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation. Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).
- Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity. Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).
