छोटी बूंद डिजिटल ट्रैप (ddTRAP): छोटी बूंद डिजिटल Polymerase चेन रिएक्शन करने के लिए Telomere दोहराने प्रवर्धन प्रोटोकॉल के अनुकूलन
Summary
हम सफलतापूर्वक मानक telomere दोहराने प्रवर्धन प्रोटोकॉल (जाल) परख परिवर्तित करने के लिए छोटी बूंद डिजिटल पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रियाओं में कार्यरत हो । यह नई परख, ddtrap कहा जाता है, और अधिक संवेदनशील और मात्रात्मक है, बेहतर पता लगाने और विभिंन मानव कोशिकाओं के भीतर टेलोमिरेज गतिविधि के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए अनुमति दी ।
Abstract
Telomere दोहराने प्रवर्धन प्रोटोकॉल (जाल) एक दिया एक नमूना के भीतर telomere गतिविधि का पता लगाने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया परख है । पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) आधारित विधि सबसे सेल lysates से एंजाइम गतिविधि के मजबूत माप के लिए अनुमति देता है । Fluorescently लेबल प्राइमरों के साथ जेल आधारित जाल नमूना throughput सीमा, और नमूनों में मतभेदों का पता लगाने की क्षमता दो गुना या एंजाइम गतिविधि में अधिक से अधिक परिवर्तन करने के लिए प्रतिबंधित है. छोटी बूंद डिजिटल जाल, ddtrap, एक अत्यंत संवेदनशील दृष्टिकोण है कि पारंपरिक जाल परख से संशोधित किया गया है, उपयोगकर्ता को सक्षम करने के लिए प्रति रन ९६ नमूनों पर एक मजबूत विश्लेषण करने के लिए और डीएनए के निरपेक्ष परिमाणन प्राप्त (telomerase विस्तार उत्पादों ) प्रत्येक पीसीआर के भीतर इनपुट । इसलिए, नव विकसित ddtrap परख पारंपरिक जेल आधारित जाल परख की सीमाओं पर काबू पा और एक अधिक कुशल, सटीक, और प्रयोगशाला और नैदानिक सेटिंग्स के भीतर टेलोमिरेज गतिविधि को मापने के लिए मात्रात्मक दृष्टिकोण प्रदान करता है ।
Introduction
Telomeres गतिशील डीएनए-रेखीय गुणसूत्र के सिरों पर प्रोटीन परिसरों हैं । मानव telomeres के एक सरणी से बना रहे है 5 ‘-TTAGGGn hexameric दोहराता है जो 12 के बीच लंबाई में अलग–15 किलोबाइट (kb) में जन्म1। मानव telomerase, ribonucleoprotein एंजाइम है कि telomerase का कहना है, सबसे पहले HeLa सेल lysates (कैंसर सेल लाइन)2में पहचाना गया था । साथ में, telomeres और telomeres जीनोम संरक्षण, जीन विनियमन, और कैंसर सेल अमरत्व3,4,5,6के रूप में जैविक प्रक्रियाओं के एक स्पेक्ट्रम में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं ।
मानव टेलोमिरेज मुख्य रूप से दो प्रमुख घटकों, अर्थात् टेलोमिरेज रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस और टेलोमिरेज आरएनए (htert और htert, क्रमशः) के शामिल है । प्रोटीन उपइकाई, hTERT, टेलोमेरेज एंजाइम के उत्प्रेरक के रूप में सक्रिय रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस घटक है । आरएनए टेम्पलेट, hterc, टेलोमिरेज प्रदान करता है और विस्तार करने के लिए टेंपलेट के साथ/ अधिकांश मानव दैहिक ऊतकों का कोई detectable टेलोमेरेज क्रियाकलाप नहीं है । डीएनए पॉलीमरेज की अक्षमता के साथ-साथ टेलोमेरेज की कमी के साथ डीएनए के पश्चगामी भूग्रस्त का विस्तार करने के लिए कोशिकीय विभाजन के हर दौर के बाद टेमराज का उत्तरोत्तर छोटा हो जाता है । इन घटनाओं सबसे दैहिक कोशिकाओं में telomere छोटा करने के लिए नेतृत्व जब तक वे एक गंभीर रूप से छोटा लंबाई तक पहुँचने, जिससे कोशिकाओं रेचक जीर्णता के एक राज्य में प्रवेश. बार एक सेल विभाजित कर सकते है की अधिकतम संख्या अपनी telomere लंबाई से तय है और जारी सेल डिवीजन के लिए इस ब्लॉक के लिए oncogenesis7के लिए प्रगति को रोकने के लिए सोचा है । कैंसर की कोशिकाओं को telomere प्रेरित replicative जीर्णता पर काबू पाने के लिए और telomere का उपयोग करने के लिए उनके telomere बनाए रखने के लिए जारी रखने में सक्षम हैं । कैंसर का लगभग ९०% टेलोमिरेज सक्रिय है, टेलोमिरेज गंभीर रूप से महत्वपूर्ण गतिविधि बनाने के दोनों में जांच और उपचार ।
1990 के दशक में जाल परख के विकास टेलोमिरेज एंजाइम के आवश्यक घटकों की पहचान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी, के रूप में अच्छी तरह के रूप में कोशिकाओं और ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला में टेलोमिरेज के मापन के लिए, दोनों सामांय और कैंसर । मूल जेल आधारित पीसीआर परख रेडियोसक्रिय रूप से डीएनए substrates लेबल के लिए टेलोमिरेज गतिविधि का पता लगाने का इस्तेमाल किया । २००६ में, परख एक nonradioactive रूप में अनुकूलित किया गया fluorescently का उपयोग कर8,9substrates लेबल । Fluorescently लेबल substrates का उपयोग करके, उपयोगकर्ताओं को यह सही उत्तेजना तरंगदैर्ध्य को उजागर द्वारा एक जेल पर बैंड के रूप में टेलोमिरेज विस्तार उत्पादों कल्पना करने में सक्षम थे । जाल परख और इसके लिए कच्चे तेल की सेल lysates में टेलोमिरेज गतिविधि का पता लगाने की क्षमता की संवेदनशीलता इस परख टेलोमिरेज गतिविधि का पता लगाने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि बना दिया है । हालांकि, जाल परख की सीमाएं हैं । परख जेल आधारित है, यह कठिन प्रदर्शन करने के लिए उदार उच्च throughput अध्ययन करने के लिए, और इस प्रकार, उचित सांख्यिकीय विश्लेषण शायद ही कभी हासिल की है । इसके अलावा, जेल आधारित परख के लिए मज़बूती से नमूनों के बीच टेलोमिरेज गतिविधि में कम दोहरा मतभेदों से पता लगाने की अक्षमता की वजह से मुश्किल है । इन दो सीमाओं पर काबू पाने एंजाइमी गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण है assays है जैसे जाल रोगी नमूनों या दवा डिजाइन अध्ययन में टेलोमिरेज गतिविधि का पता लगाने के लिए नैदानिक या उद्योग सेटिंग्स में ले जाने के लिए ।
डिजिटल पीसीआर को प्रारंभ में १९९९ में पीसीआर के घातीय और एनालॉग प्रकृति को एक रैखिक और डिजिटल परख10में परिवर्तित करने के लिए एक साधन के रूप में विकसित किया गया था । छोटी बूंद डिजिटल पीसीआर (ddPCR) मूल डिजिटल पीसीआर प्रणाली के सबसे हाल ही में नवाचार है । छोटी बूंद डिजिटल पीसीआर उंनत microfluidics और तेल में पानी पायस रसायन के आगमन के साथ मज़बूती से स्थिर और समान रूप से आकार बूंदों उत्पंन करने के लिए आया था । जेल आधारित और यहां तक कि मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) के विपरीत, ddPCR इनपुट सामग्री का पूर्ण प्रमात्रीकरण उत्पंन करता है । DdPCR के लिए कुंजी ~ २०,००० बूंदों में विभाजन नमूनों द्वारा व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं की पीढ़ी है । अंत बिंदु पीसीआर के बाद, छोटी बूंद पाठक एक प्रवाह-cytometer की तरह फैशन, गिनती, नौकरशाही का आकार घटाने में प्रत्येक छोटी बूंद को स्कैन, और उपस्थिति या प्रत्येक व्यक्ति छोटी बूंद में प्रतिदीप्ति की अनुपस्थिति रिकॉर्डिंग (यानी, अनुपस्थिति या प्रत्येक छोटी बूंद में पीसीआर amplicons की उपस्थिति) । फिर, पॉसन के वितरण का उपयोग करके, इनपुट अणुओं को बूंदों की कुल संख्या के लिए सकारात्मक बूंदों के अनुपात के आधार पर अनुमान लगाया जाता है । यह संख्या प्रत्येक पीसीआर में इनपुट अणुओं की संख्या का अनुमान दर्शाती है । इसके अलावा, ddpcr प्रदर्शन किया है और एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट जो उपयोगकर्ता कई नमूनों को चलाने के लिए, साथ ही जैविक और तकनीकी उचित सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए प्रतिकृति प्रदर्शन की अनुमति देता है पर विश्लेषण । परिणामस्वरूप, हमने डीडीपीसीआर की शक्तिशाली मात्रा और मॉडरेट थ्रूपुट प्रकृति को ट्रैप परख के साथ जोड़ दिया है ताकि डीडीट्रैप आमापन11को विकसित किया जा सके । इस परख के लिए उपयोगकर्ताओं के अध्ययन के लिए डिज़ाइन किया गया है और दृढ़ता से जैविक नमूनों11,12से पूर्ण टेलोमिरेज गतिविधि मात्रा ठहराना । Ddtrap की संवेदनशीलता सीमित और कीमती नमूनों से टेलोमिरेज गतिविधि की मात्रा, एकल कोशिका माप सहित की अनुमति देता है । इसके अलावा, उपयोगकर्ताओं को भी टेलोमिरेज जोड़तोड़ के प्रभाव का अध्ययन कर सकते है और/या दवाओं के पूर्ण प्रमात्रीकरण से कम दोहरा परिवर्तन (~ ५०% मतभेद) । DdTRAP आधुनिक प्रयोगशाला प्रयोगों और नैदानिक सेटिंग्स की डिजिटल और उच्च थ्रूपुट प्रकृति में जाल परख के प्राकृतिक विकास है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
टेलोमिरेज गतिविधि की माप सहित अनुसंधान विषयों के एक बहुतायत के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन तक ही सीमित नहीं, कैंसर, टेलोमिरेज जीवविज्ञान, उंर बढ़ने, पुनर्योजी चिकित्सा, और संरचना आधारित दवा डिजाइन । Telomerase RNP…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (NIH) (NCI-R00-CA197672-01A1) से धन स्रोतों को स्वीकार करना चाहते हैं । छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर लाइनों (SHP77 और H82) Drs से एक उदार उपहार थे । जॉन Minna और आदि Gazdar यूटी पश्चिमी चिकित्सा केंद्र से ।
Materials
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
Referências
- Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell. 59 (3), 521-529 (1989).
- de Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Role of telomeres and telomerase in cancer. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).
- Kim, W., Shay, J. W. Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD). Differentiation. 99, 1-9 (2018).
- Robin, J. D., et al. Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances. Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase. Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).
- Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Enhanced detection of human telomerase activity. DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).
- Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol. Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).
- Huang, E. E., et al. The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation. Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).
- Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity. Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).
