Droplet Digital TRAP (ddTRAP): adattamento del protocollo di amplificazione di ripetizione telomere a droplet reazione a catena della polimerasi digitale
Summary
Abbiamo convertito con successo il saggio di protocollo di amplificazione (TRAP) di teleomere standard per essere impiegato nelle reazioni a catena della polimerasi digitale delle gocce. Questo nuovo saggio, chiamato ddTRAP, è più sensibile e quantitativo, permettendo una migliore rilevazione e analisi statistica dell’attività telomerasi all’interno di varie cellule umane.
Abstract
Il protocollo di amplificazione di ripetizione dei telomeri (trap) è il saggio più diffuso per rilevare l’attività telomerasi all’interno di un dato campione. Il metodo basato sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) consente misurazioni robuste dell’attività enzimatica dalla maggior parte dei lisati cellulari. Il TRAP a base di gel con primer con etichetta fluorescente limita la velocità di campionamento e la capacità di rilevare le differenze nei campioni è limitata a due o più cambiamenti nell’attività enzimatica. Il goccia Digital trap, ddtrap, è un approccio altamente sensibile che è stato modificato dal tradizionale saggio TRAP, permettendo all’utente di eseguire un’analisi robusta su 96 campioni per corsa e ottenere una quantificazione assoluta del DNA (prodotti di estensione telomerasi ) all’interno di ciascuna PCR. Pertanto, il saggio ddTRAP di nuova concezione supera i limiti del tradizionale saggio TRAP basato su gel e fornisce un approccio più efficiente, accurato e quantitativo per misurare l’attività della telomerasi all’interno di contesti clinici e di laboratorio.
Introduction
I telomeri sono complessi di proteine del DNA dinamici alle estremità dei cromosomi lineari. I telomeri umani sono composti da una serie di ripetizioni di 5′-TTAGGGn formazione del esamerico che variano in lunghezza tra 12 – 15 chilobasi (KB) alla nascita1. La telomerasi umana, l’enzima ribonucleoproteina che mantiene i telomeri, è stato identificato per la prima volta nei lisati delle cellule di hela (linea cellulare tumorale)2. Insieme, telomeri e telomerasi giocano un ruolo importante in uno spettro di processi biologici come la protezione del genoma, la regolazione genica e l’immortalità delle cellule tumorali3,4,5,6.
La telomerasi umana è costituita principalmente da due componenti chiave, vale a dire la trascrittasi inversa telomerasi e l’RNA telomerasi (hTERT e hTERC, rispettivamente). La subunità proteica, hTERT, è la componente della trascrittasi inversa caticamente attiva dell’enzima telomerasi. Il modello di RNA, hTERC, fornisce telomerasi con il modello per estendere e/o mantenere i telomeri. La maggior parte dei tessuti somatici umani non hanno un’attività di telomerasi rilevabile. L’incapacità della DNA polimerasi di estendere la fine del filamento di DNA in ritardo, insieme alla mancanza di telomasi, porta all’accorciamento progressivo dei telomeri dopo ogni round di divisione cellulare. Questi fenomeni portano a un accorciamento dei telomeri nella maggior parte delle cellule somatiche fino a raggiungere una lunghezza criticamente abbreviata, per cui le cellule entrano in uno stato di senescenza replicativa. Il numero massimo di volte che una cellula può dividere è dettato dalla sua lunghezza telomeri e questo blocco alla divisione cellulare continua è pensato per prevenire la progressione a oncogenesi7. Le cellule tumorali sono in grado di superare la senescenza replicativa indotta da telomere e continuano a proliferare utilizzando telomerasi per mantenere i loro telomeri. Circa il 90% dei tumori attiva la telomerasi, rendendo l’attività della telomerasi di importanza critica sia nel rilevamento che nel trattamento del cancro.
Lo sviluppo del saggio TRAP negli anni novanta è stato determinante per l’identificazione dei componenti necessari dell’enzima telomerasi, nonché per la misurazione della telomerasi in una vasta gamma di cellule e tessuti, sia normali che cancerogene. Il saggio originale basato su gel PCR ha utilizzato substrati del DNA radioattivi etichettati per rilevare l’attività della telomerasi. Nel 2006, il saggio è stato adattato in forma non radioattiva utilizzando substrati con etichetta fluorescente8,9. Utilizzando substrati con etichetta fluorescente, gli utenti sono stati in grado di visualizzare i prodotti di estensione telomerasi come bande su un gel esponendolo alla lunghezza d’onda di eccitazione corretta. La sensibilità del saggio TRAP e la sua capacità di rilevare l’attività telomerasi nei lisati di cellule grezze ha reso questo saggio il metodo più diffuso per il rilevamento dell’attività telomerasi. Tuttavia, il test TRAP ha dei limiti. Il saggio è a base di gel, rendendo difficile eseguire i replicati necessari negli studi a throughput medio-alto, e quindi, una corretta analisi statistica è raramente raggiunta. Inoltre, il saggio a base di gel è difficilmente quantificabile in modo affidabile a causa dell’incapacità di rilevare meno di due differenze nell’attività di telomerasi tra i campioni. Il superamento di queste due limitazioni è fondamentale per i saggi di attività enzimatica, come il TRAP, per passare a impostazioni cliniche o industriali per il rilevamento dell’attività di telomerasi nei campioni dei pazienti o negli studi sulla progettazione di farmaci.
La PCR digitale è stata inizialmente sviluppata in 1999 come mezzo per convertire la natura esponenziale e analogica della PCR in un saggio lineare e digitale10. La PCR digitale droplet (ddPCR) è l’innovazione più recente della metodologia di PCR digitale originale. La PCR digitale droplet è arrivata con l’avvento della microfluidica avanzata e della chimica dell’emulsione olio-in-acqua per generare in modo affidabile goccioline stabili e di dimensioni uguali. A differenza della PCR (qPCR) a base di gel e persino quantitativa, la ddPCR genera una quantificazione assoluta del materiale in ingresso. La chiave per ddPCR è la generazione di ~ 20.000 reazioni individuali di partizionamento di campioni in goccioline. Dopo la PCR end-point, il lettore di gocce scansiona ogni goccia in modo simile a un citometro a flusso, contando, ridimensionando e registrando la presenza o l’assenza di fluorescenza in ogni singola goccia (cioè assenza o presenza di ampliconi PCR in ogni goccia). Quindi, utilizzando la distribuzione di Poisson, le molecole di input sono stimate in base al rapporto delle goccioline positive al numero totale di goccioline. Questo numero rappresenta una stima del numero di molecole di input in ogni PCR. Inoltre, ddPCR viene eseguita e analizzata su una piastra di 96 pozzetti che consente all’utente di eseguire molti campioni, nonché di eseguire repliche biologiche e tecniche per un’adeguata analisi statistica. Di conseguenza, abbiamo combinato la potente quantificazione e la natura a throughput moderato di ddPCR con il saggio TRAP per sviluppare il saggio ddTRAP11. Questo saggio è progettato per gli utenti di studiare e quantificare in modo robusto l’attività di telomerasi assoluta da campioni biologici11,12. La sensibilità del ddTRAP consente la quantificazione dell’attività telomerasi da campioni limitati e preziosi, comprese le misurazioni a cella singola. Inoltre, gli utenti possono anche studiare gli effetti delle manipolazioni telomerasi e/o farmaci con quantificazione assoluta di meno di due cambiamenti (~ 50% differenze). Il ddTRAP è la naturale evoluzione del saggio TRAP nella natura digitale e ad alto rendimento dei moderni esperimenti di laboratorio e delle impostazioni cliniche.
Protocol
Representative Results
Discussion
La misurazione dell’attività di telomerasi è fondamentale per una pletora di argomenti di ricerca tra cui, ma non limitati a, cancro, biologia dei telomeri, invecchiamento, medicina rigenerativa e progettazione di farmaci basati sulla struttura. Telomerasi RNP sono bassi abbondanti, anche nelle cellule tumorali, rendendo la rilevazione e lo studio di questo enzima impegnativo. In questo documento, abbiamo descritto le procedure passo-passo per il saggio ddTRAP di nuova concezione per quantificare in modo affidabile l’a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere le fonti di finanziamento degli istituti nazionali di sanità (NIH) (NCI-R00-CA197672-01A1). Le linee di carcinoma polmonare a piccole cellule (SHP77 e H82) erano un dono generoso di DRS. John Minna e Adi Gazdar dal centro medico UT Southwestern.
Materials
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
Referências
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