물방울 디지털 트랩 (ddTRAP): Telomere 반복 증폭 프로토콜의 적응은 디지털 중 합 효소 연쇄 반응에 액 적
Summary
저희는 액 적 디지털 중 합 효소 연쇄 반응에 사용 되는 표준 telomere 반복 증폭 프로토콜 (TRAP) 분석 법을 성공적으로 전환 했습니다. DdTRAP 이라고 불리는이 새로운 분석은 더 민감하고 정량적 이며, 다양 한 인간 세포 내에서의 텔로 활동에 대 한 더 나은 검출 및 통계적 분석을 가능 하 게 합니다.
Abstract
Telomere 반복 증폭 프로토콜 (TRAP)은 주어진 샘플 내에서 텔로 활성을 검출 하기 위해 가장 널리 사용 되는 분석 법입니다. 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기반 방법은 대부분의 세포 용 해물에서 효소 활성을 강력 하 게 측정할 수 있습니다. 형광 표지 된 프라이 머를 사용한 겔 기반 트랩은 시료 처리량을 제한 하 고 시료의 차이를 검출 하는 능력은 효소 활성의 2 배 또는 그 이상의 변화에 제한 됩니다. 물방울 디지털 트랩 인 ddTRAP은 기존의 트랩 분석에서 수정 된 매우 민감한 접근 방식으로, 사용자가 96 샘플에 대 한 강력한 분석을 수행 하 고 DNA (텔로 확장 제품의 절대 정량화를 얻을 수 있게 합니다. ) 각 PCR 내 입력. 따라서 새로 개발 된 ddTRAP 분석은 기존의 겔 기반 트랩 분석의 한계를 극복 하 고 실험실 및 임상 설정 내에서 텔로 활동을 측정 하는 보다 효율적이 고 정확 하며 정량적 인 접근법을 제공 합니다.
Introduction
텔로 미 어는 선형 염색체의 말단에 있는 동적인 DNA 단백질 복합물입니다. 인간 말단 소 립은1번에서 12hexameric kilobases 사이의 길이에 따라 달라 지는 5 ‘-TTAGGGn 의 반복의 배열로 구성 된다. 말단 소 립을 유지 하는 ribonucleoprotein 효소 인 인간 텔로는, 헬 라 세포 용 해물 (암 세포 라인)에서 먼저 동정 되었다. 말단 소 립 및 텔로는 게놈 보호, 유전자 조절 및 암 세포 불멸3,5,6과 같은 생물학적 과정의 스펙트럼에서 중요 한 역할을 한다.
인간의 텔로는 주로 두 가지 주요 구성 요소, 즉 텔로 역 역전사 및 텔로 RNA (각각 hTERT 및 hTERC)로 구성 됩니다. 상기 단백질 서브 유닛 hTERT는, 텔로 효소의 촉매 활성 역 역전사 성분 이다. RNA 템플릿 hTERC는 말단 소 립을 연장 및/또는 유지 하기 위해 템플릿과 텔로을 제공 한다. 대부분의 인체 체세포 조직에는 검출 가능한 텔로 활동이 없습니다. 텔로의 부족과 함께 dna의 지체 가닥의 끝을 확장 하는 DNA 중 합 효소의 무 능력은 세포 분열의 매 라운드 후에 말단 소 립의 점진적 단축으로 이끌어 냅니다. 이 현상은 세포가 복제 적인 노 쇠의 상태를 입력 하는 결정적으로 단축 된 길이에 도달할 때까지 대부분의 체세포에 있는 telomere 단축으로 이끌어 냅니다. 세포 분열의 최대 횟수는 그것의 telomere 길이에 의해 결정 되 고 지속적인 세포 분할에이 블록은 발암에 진행을 방지 하는 것으로 생각 된다7. 암 세포는 telomere 유도 된 복제 노 광을 극복 하 고 그들의 말단 소 립을 유지 하기 위해 텔로를 이용 하 여 증식을 계속할 수 있다. 암의 약 90%는 텔로를 활성화 하 고, 암 탐지와 처리 둘 다에 있는 텔로 활동을 비판적으로 중요 하 게 합니다.
1990 년대에 있는 함정 분석의 발달은 텔로 효소의 필요한 성분의 식별 뿐만 아니라 정상과 암 모두의 광범위 한 세포 및 조직에서 텔로의 측정에 중요 한 역할을 했습니다. 본래의 젤 기반 PCR 분석 법은 방사선 학적으로 표지 된 DNA 기질을 사용 하 여 텔로 활성을 검출 합니다. 2006에서, 분석은 형광 표지 된 기판8,9를 사용 하 여 비 방사성 형태로 적응 되었다. 형광 표지 된 기질을 사용 하 여, 사용자는 정확한 여기 파장에 노출 하 여 젤에 밴드로 텔로 확장 제품을 시각화할 수 있었습니다. 트랩 분석의 민감도와 조 세포 용 해물에서 텔로 활성을 검출 하는 능력은이 분석을 텔로 활성 검출을 위해 가장 널리 사용 되는 방법으로 만들었다. 그러나, 함정 분석에는 한계가 있습니다. 이 분석은 젤 기반으로, 보통에서 고 처리량 연구에 필요한 복제를 수행 하는 것을 어렵게 만들고, 따라서 적절 한 통계 분석이 거의 이루어지지 않습니다. 더욱이, 겔 계 분석은 샘플 들 간의 텔로 활성에서의 두 배 차이 미만의 검출의 무 능력으로 인하여 신뢰성 있게 정량화 하기 어렵다. 이러한 두 가지 한계를 극복 하는 것은 환자 샘플 또는 약물 설계 연구에서 텔로 활성의 검출을 위한 임상 또는 산업 설정으로 이동 하는 트랩 등의 효소 활성 분석에 중요 하다.
디지털 PCR은 초기에 PCR의 지 수 및 아날로그 특성을 선형 및 디지털 분석 (10)으로 변환 하는 수단으로 1999에서 개발 되었다. 액 적 디지털 PCR (ddPCR)은 본래 디지털 PCR 방법론의 가장 최근의 혁신 이다. 액 적 디지털 PCR은 안정적이 고 균일 한 크기의 방울을 안정적으로 생성 하는 고급 미세 유체 및 수 중유 에멀젼 화학의 출현으로 탄생 했습니다. 겔 계 및 정량 PCR (qPCR)과는 달리, ddPCR은 투입 물질의 절대 정량화를 생성 한다. DdPCR의 핵심은 샘플을 방울로 분할 하 여 ~ 2만 개별 반응의 생성입니다. 종말 점 PCR 다음에, 액 적 독자는 각 물방울에 있는 형광의 존재 또는 부재를 계산 하 고, 크기 조정 하 고, 기록 하는 유 세포 미터와 같은 유행에 있는 각 방울을 검사 합니다 (즉, 각 물방울에 있는 PCR 앰 플 아이콘의 유무 또는 존재). 그런 다음 푸아송 분포를 사용 하 여 입력 분자는 총 물방울 수에 대 한 양의 물방울의 비율을 기준으로 추정 됩니다. 이 숫자는 각 PCR의 입력 분자 수의 추정치를 나타냅니다. 또한, ddPCR은 96-웰 플레이트에서 수행 되 고 분석 되어 사용자가 많은 샘플을 실행 하 고 적절 한 통계 분석을 위해 생물학적 및 기술적 복제를 수행할 수 있습니다. 이에 따라 ddPCR의 강력한 정량 및 적정 처리량 특성을 결합 하 여 Ddpcr 분석 (11)을 개발 하였다. 이 분석은 사용자가 생물학적 샘플11,12에서 절대 텔로 활성을 연구 하 고 견고 하 게 정량화 하도록 설계 되었습니다. DdTRAP의 민감도는 단일 셀 측정을 포함 하 여 제한적이 고 귀중 한 샘플 로부터 텔로 활성의 정량화를 가능 하 게 합니다. 또한, 사용자는 텔로 조작 및/또는 약물의 두 가지 변화 (~ 50% 차이) 미만의 절대적인 정량화를 통해 효과를 연구할 수 있습니다. DdTRAP은 현대 실험실 실험과 임상 설정의 디지털 및 높은 처리량 특성에 대 한 트랩 분석의 자연 스러운 진화입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
텔로 활동의 측정은 암, telomere 생물학, 노화, 재생 의학 및 구조 기반 약물 설계를 포함 하 되이에 국한 되지 않는 과다 한 연구 주제에 매우 중요 합니다. 텔로 RNPs는 낮은 풍부, 조차 암 세포에서,이 효소의 탐지 그리고 연구 만들기 도전. 이 논문에서는 새로 개발 된 ddTRAP 분석에 대 한 단계별 절차를 설명 하 여 세포에서 텔로 활성을 견고 하 게 정량화 했습니다. 기존의 텔로 확장 반응과 ddPCR을 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 국립 보건부 (NIH)의 자금 출처를 인정 하 고 싶습니다 (R00-CA197672-01A1). 작은 세포 폐암 라인 (SHP77 및 H82)은 UT 사우스 웨스턴 메디컬 센터에서 존 미 나와 아디가 르 다에서 관대 한 선물 이었다.
Materials
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
Referências
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