ARMADILHA digital da gota (ddTRAP): adaptação do protocolo da amplificação da repetição de telomere à reacção em cadeia da polimerase de droplet Digitas
Summary
Nós convertemos com sucesso o ensaio padrão do protocolo da amplificação da repetição do telomere (armadilha) a ser empregado em reações Chain digitais do polymerase da gota. Este novo ensaio, chamado ddTRAP, é mais sensível e quantitativo, permitindo uma melhor detecção e análise estatística da atividade de telomerase dentro de várias células humanas.
Abstract
O protocolo da amplificação da repetição do telomere (armadilha) é o ensaio o mais extensamente usado para detectar a atividade do telomerase dentro de um dado uma amostra. A reacção em cadeia do polymerase (PCR)-baseou o método permite medidas robustas da atividade de enzima da maioria de lysates da pilha. A armadilha baseada em gel com primers com rótulo fluorescente limita a taxa de transferência da amostra, e a capacidade de detectar diferenças nas amostras é restrita a duas vezes ou mais alterações na atividade enzimática. A armadilha digital da gota, ddTRAP, é uma aproximação altamente sensível que seja modificada do ensaio tradicional da armadilha, permitindo que o usuário realize uma análise robusta em 96 amostras por a execução e obtenha a quantificação absoluta do ADN (produtos da extensão do telomerase ) de entrada dentro de cada PCR. Conseqüentemente, o ensaio recentemente desenvolvido de ddTRAP supera as limitações do ensaio tradicional gel-baseado da armadilha e fornece uma aproximação mais eficiente, exata, e quantitativa para medir a atividade do telomerase dentro do laboratório e das configurações clínicas.
Introduction
Telômeros são complexos de proteína de DNA dinâmicos nas extremidades dos cromossomas lineares. Os telômeros humanos são compostos de uma matriz de 5 ‘-TTAGGGn repetições hexamérica que variam de comprimento entre 12 – 15 kilobases (KB) ao nascimento1. A telomerase humana, a enzima ribonucleoproteína que mantém os telómeros, foi identificada pela primeira vez em lisados de células HeLa (linha celular cancerosa)2. Juntos, telómeros e telomerase desempenham um papel importante em um espectro de processos biológicos, como proteção do genoma, regulação gênica e imortalidade de células cancerosas3,4,5,6.
O telomerase humano é compreendido primeiramente de dois componentes chaves, a saber o transcriptase reverso do telomerase e o RNA do telomerase (hTERT e hTERC, respectivamente). O subunit da proteína, hTERT, é o componente reverso catalètica ativo do transcriptase da enzima do telomerase. O molde do RNA, hTERC, fornece o telomerase com o molde para estender e/ou manter telômeros. A maioria dos tecidos somáticos humanos não têm atividade de telomerase detectável. A incapacidade de DNA polimerase para estender o fim da costa retardada de DNA, juntamente com a falta de telomerase leva ao encurtamento progressivo de telômeros após cada rodada de divisão celular. Estes fenômenos conduzem ao encurtamento do telomere em a maioria de pilhas somáticas até que alcancem um comprimento crìtica encurtado, por meio de que as pilhas entram em um estado da senescência replicativa. O número máximo de vezes que uma célula pode dividir é ditada pelo comprimento do telômero e este bloco para a continuação da divisão celular é pensado para prevenir a progressão para a oncogênese7. As células cancerosas são capazes de superar a senescência replicativa induzida por telômeros e continuam a proliferar utilizando a telomerase para manter seus telómeros. Aproximadamente 90% dos cânceres ativam a telomerase, tornando a atividade de telomerase extremamente importante na detecção e tratamento do câncer.
O desenvolvimento do ensaio TRAP na década de 1990 foi fundamental na identificação dos componentes necessários da enzima telomerase, bem como para a mensuração da telomerase em uma ampla gama de células e tecidos, tanto normais quanto cancerosas. O ensaio de PCR baseado em gel original utilizou substratos de DNA rotulados radioativamente para detectar atividade de telomerase. Em 2006, o ensaio foi adaptado para uma forma não radioativa usando substratos fluorescenterotulados8,9. Usando substratos fluorescente etiquetados, os usuários puderam Visualizar os produtos da extensão do telomerase como as faixas em um gel expondo o ao comprimento de onda correto da excitação. A sensibilidade do ensaio TRAP e sua capacidade de detectar atividade de telomerase em lisados de células brutas fez deste ensaio o método mais utilizado para a detecção de atividade de telomerase. No entanto, o ensaio TRAP tem limitações. O ensaio é baseado em gel, dificultando a realização das repetições necessárias em estudos de moderada a alta produtividade, e assim, a análise estatística adequada raramente é alcançada. Além disso, o ensaio baseado em gel é difícil de quantificar de forma confiável devido à incapacidade de detectar menos de duas diferenças na atividade de telomerase entre as amostras. Superar essas duas limitações é fundamental para ensaios de atividade enzimática, como o TRAP, para se deslocar para as configurações clínicas ou da indústria para a detecção de atividade de telomerase em amostras de pacientes ou estudos de projeto de drogas.
O PCR de Digitas foi desenvolvido inicialmente no 1999 como meios converter a natureza exponencial e análoga do PCR em um ensaio linear e digital10. O PCR digital do droplet (ddPCR) é a inovação a mais recente da metodologia digital original do PCR. O PCR digital da gota veio aproximadamente com o advento do microfluídica avançado e da química da emulsão do óleo-em-água para gerar confiantemente gotas estáveis e ingualmente feitas medida. Ao contrário do PCR gel-based e mesmo quantitativo (qPCR), ddPCR gera a quantificação absoluta do material da entrada. A chave para ddPCR é a geração de ~ 20.000 reações individuais por particionamento de amostras em gotas. Após o PCR do ponto final, o leitor da gota examina cada gota em um fluxo-cytometer-como a forma, contando, dimensionando, e registrando a presença ou a ausência de fluorescência em cada gota individual (isto é, ausência ou presença de amplicons do PCR em cada gota). Em seguida, usando a distribuição de Poisson, as moléculas de entrada são estimadas com base na proporção de gotas positivas para o número total de gotículas. Este número representa uma estimativa do número de moléculas de entrada em cada PCR. Além disso, o ddPCR é executado e analisado em uma placa do 96-well que permita que o usuário execute muitas amostras, assim como executa réplicas biológicas e técnicas para a análise estatística apropriada. Em conseqüência, nós combinamos a natureza poderosa da quantificação e da moderado-taxa de ddPCR com o ensaio da armadilha para desenvolver o ensaio de ddTRAP11. Este ensaio é projetado para que os usuários estudem e quantifiquem de forma robusta a atividade de telomerase absoluta a partir de amostras biológicas11,12. A sensibilidade do ddTRAP permite a quantificação da atividade de telomerase de amostras limitadas e preciosas, incluindo medições de células únicas. Além disso, os usuários também podem estudar os efeitos de manipulações de telomerase e/ou drogas com quantificação absoluta de menos de duas alterações (~ 50% de diferenças). O ddTRAP é a evolução natural do ensaio TRAP na natureza digital e de maior rendimento de experimentos laboratoriais modernos e ambientes clínicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
A medida da atividade da telomerase é crítica a uma pletora de tópicos da pesquisa que incluem, mas não limitado a, cancro, biologia do telomere, envelhecimento, medicina regenerativa, e projeto estrutura-baseado da droga. Telomerase RNPs são de baixa abundância, mesmo em células cancerosas, fazendo a detecção e estudo desta enzima desafiador. Neste artigo, nós descrevemos os procedimentos passo a passo para o ensaio recentemente desenvolvido de ddTRAP para quantificar robustamente a atividade do telomerase nas…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de reconhecer fontes de financiamento dos institutos nacionais de saúde (NIH) (NCI-r00-CA197672-01A1). As linhas de câncer de pulmão de pequenas células (SHP77 e H82) foram um presente generoso dos Drs. John Minna e Adi Gazdar do UT Southwestern Medical Center.
Materials
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
Referências
- Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell. 59 (3), 521-529 (1989).
- de Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Role of telomeres and telomerase in cancer. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).
- Kim, W., Shay, J. W. Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD). Differentiation. 99, 1-9 (2018).
- Robin, J. D., et al. Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances. Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase. Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).
- Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Enhanced detection of human telomerase activity. DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).
- Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol. Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).
- Huang, E. E., et al. The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation. Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).
- Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity. Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).
