TRAMPA digital de gota (ddTRAP): adaptación del Protocolo de amplificación de repetición de telómeros a la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas
Summary
Hemos convertido con éxito el ensayo estándar de protocolo de amplificación de repetición de telómeros (TRAP) que se empleara en las reacciones de la cadena de polimerasa digital de gotas. Este nuevo ensayo, llamado ddTRAP, es más sensible y cuantitativo, lo que permite una mejor detección y análisis estadístico de la actividad de la telomerasa dentro de varias células humanas.
Abstract
El protocolo de amplificación de repetición de telómeros (TRAP) es el ensayo más ampliamente utilizado para detectar la actividad de la telomerasa dentro de una muestra determinada. El método basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite mediciones robustas de la actividad enzimática de la mayoría de los lisatos celulares. El TRAP basado en gel con imprimadores con etiquetas fluorescentemente limita el rendimiento de la muestra, y la capacidad de detectar diferencias en las muestras está restringida a dos pliegues o mayores cambios en la actividad enzimática. El TRAP digital de gota, ddTRAP, es un enfoque altamente sensible que ha sido modificado a partir del ensayo TRAP tradicional, permitiendo al usuario realizar un análisis robusto en 96 muestras por corrida y obtener la cuantificación absoluta de los productos de DNA (extensión de telomerasa ) dentro de cada PCR. Por lo tanto, el ensayo ddTRAP recientemente desarrollado supera las limitaciones del ensayo TRAP tradicional basado en gel y proporciona un enfoque más eficiente, preciso y cuantitativo para medir la actividad de la telomerasa en entornos clínicos y de laboratorio.
Introduction
Los telómeros son complejos de ADN-proteína dinámicos en los extremos de los cromosomas lineales. Los telómeros humanos se componen de una serie de repeticiones hexamericas de 5 ‘-TTAGGGn que varían en longitud entre 12 – 15 kilobases (KB) al nacer1. La telomerasa humana, la enzima ribonucleoproteína que mantiene los telómeros, se identificó por primera vez en los lisados de las células de la Hela (línea de células cancerosas)2. Juntos, los telómeros y la telomerasa desempeñan un papel importante en un espectro de procesos biológicos como la protección del genoma, la regulación génica y la inmortalidad de las células cancerosas3,4,5,6.
La telomerasa humana se compone principalmente de dos componentes clave, a saber, la transcriptasa inversa de telomerasa y el ARN de telomerasa (hTERT y hTERC, respectivamente). La Subunidad proteica, hTERT, es el componente catalíticamente activo de la transcriptasa inversa de la enzima telomerasa. La plantilla de ARN, hTERC, proporciona telomerasa con la plantilla para extender y/o mantener los telómeros. La mayoría de los tejidos somáticos humanos no tienen actividad de telomerasa detectable. La incapacidad de ADN polimerasa para extender el final de la hebra de ADN rezagado junto con la falta de telomerasa conduce a la reducción progresiva de los telómeros después de cada ronda de división celular. Estos fenómenos conducen al acortamiento de los telómeros en la mayoría de las células somáticas hasta que alcanzan una longitud de corta duración, donde las células entran en un estado de senescencia replicativa. El número máximo de veces que una célula puede dividirse es dictado por su longitud de telómeros y este bloque a la división celular continua se piensa para prevenir la progresión a la oncogénesis7. Las células cancerosas son capaces de superar la senescencia replicativa inducida por el telómero y continúan proliferando utilizando telomerasa para mantener sus telómeros. Aproximadamente el 90% de los cánceres activan la telomerasa, lo que hace que la actividad de la telomerasa sea sumamente importante en la detección y el tratamiento del cáncer.
El desarrollo del ensayo TRAP en la década de 1990 fue instrumental en la identificación de los componentes necesarios de la enzima telomerasa, así como para la medición de la telomerasa en una amplia gama de células y tejidos, tanto normales como cancerosos. El ensayo original de PCR basado en gel utilizó sustratos de ADN etiquetados radioactivamente para detectar la actividad de la telomerasa. En 2006, el ensayo se adaptó a una forma no radioactiva utilizando sustratos con la etiqueta fluorescencia8,9. Mediante el uso de sustratos etiquetados con fluorescencia, los usuarios pudieron visualizar los productos de extensión de telomerasa como bandas en un gel exponiéndolo a la longitud de onda de excitación correcta. La sensibilidad del ensayo TRAP y su capacidad para detectar la actividad de la telomerasa en los lisados de células crudas ha hecho de este ensayo el método más ampliamente utilizado para la detección de la actividad de la telomerasa. Sin embargo, el ensayo TRAP tiene limitaciones. El ensayo está basado en gel, por lo que es difícil realizar las réplicas necesarias en estudios de moderado a alto rendimiento, y por lo tanto, rara vez se logra un análisis estadístico adecuado. Además, el ensayo basado en gel es difícil de cuantificar de forma fiable debido a la incapacidad de detectar menos de dos diferencias en la actividad de la telomerasa entre las muestras. La superación de estas dos limitaciones es fundamental para que los ensayos de actividad enzimática, como el TRAP, se trasladen a la configuración clínica o de la industria para detectar la actividad de la telomerasa en muestras de pacientes o en estudios de diseño de fármacos.
La PCR digital se desarrolló inicialmente en 1999 como un medio para convertir la naturaleza exponencial y analógica de la PCR en un ensayo lineal y digital10. La PCR digital por gota (ddPCR) es la innovación más reciente de la metodología de PCR digital original. La PCR digital por gota surgió con la llegada de microfluidos avanzados y química de emulsión de aceite en agua para generar de forma fiable gotas estables e igualmente de tamaño. A diferencia de la PCR a base de gel e incluso cuantitativa (qPCR), la ddPCR genera una cuantificación absoluta del material de entrada. La clave de ddPCR es la generación de ~ 20.000 reacciones individuales mediante la partición de muestras en gotas. Después de la PCR de punto final, el lector de gotas escanea cada gota en una forma similar al CITOMETRO-flujo, contando, dimensionando y registrando la presencia o ausencia de fluorescencia en cada gota individual (es decir, ausencia o presencia de los amplicones PCR en cada gota). Luego, utilizando la distribución de Poisson, las moléculas de entrada se estiman en base a la relación de gotas positivas con el número total de gotas. Este número representa una estimación del número de moléculas de entrada en cada PCR. Además, la ddPCR se realiza y se analiza en una placa de pozo de 96 que permite al usuario ejecutar muchas muestras, así como realizar réplicas biológicas y técnicas para un análisis estadístico adecuado. Como resultado, hemos combinado la potente cuantificación y la naturaleza de rendimiento moderado de ddPCR con el ensayo TRAP para desarrollar el ensayo ddTRAP11. Este ensayo está diseñado para que los usuarios estudien y cuantifiquen enérgicamente la actividad de la telomerasa absoluta a partir de las muestras biológicas11,12. La sensibilidad del ddTRAP permite la cuantificación de la actividad de la telomerasa a partir de muestras limitadas y preciosas, incluyendo mediciones de una sola célula. Además, los usuarios también pueden estudiar los efectos de las manipulaciones de telomerasa y/o fármacos con cuantificación absoluta de menos de dos cambios (~ 50% diferencias). El ddTRAP es la evolución natural del ensayo TRAP en la naturaleza digital y de mayor rendimiento de los experimentos de laboratorio modernos y los entornos clínicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La medición de la actividad de la telomerasa es fundamental para una plétora de temas de investigación, incluyendo, pero no limitado a, cáncer, biología de los telómeros, envejecimiento, medicina regenerativa y diseño de fármacos basados en la estructura. Las RNP de telomerasa son muy abundantes, incluso en las células cancerosas, lo que hace que la detección y el estudio de esta enzima sean desafiantes. En este documento, describimos los procedimientos paso a paso para el nuevo ensayo ddTRAP desarrollado para …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores le gustaría reconocer las fuentes de financiación de los institutos nacionales de salud (NIH) (NCI-R00-CA197672-01A1). Las líneas de cáncer de pulmón de células pequeñas (SHP77 y H82) fueron un regalo generoso de los doctores John Minna y Adi Gazdar del centro médico del sudoeste de UT.
Materials
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
Referências
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