Bakteriecelle kultur på enkelt celleniveau inde i gigantiske vesikler
Summary
Vi demonstrerer en enkelt cellekultur af bakterier inde i gigantiske vesikler (GVs). GVS indeholdende bakterieceller blev fremstillet ved dråbe overførselsmetoden og blev immobiliseret på en understøttet membran på et glas substrat for direkte observation af bakterievækst. Denne fremgangsmåde kan også tilpasses andre celler.
Abstract
Vi udviklede en metode til dyrkning af bakterieceller på enkelt celleniveau inde i gigantiske vesikler (GVs). Bakteriel cellekultur er vigtigt for at forstå funktionen af bakterieceller i det naturlige miljø. På grund af teknologiske fremskridt kan forskellige bakteriecelle funktioner afsløres på enkelt celleniveau inde i et lukket rum. GVS er sfæriske mikro-størrelse rum består af amfifile lipid molekyler og kan holde forskellige materialer, herunder celler. I dette studie blev en enkelt bakteriecelle indkapslet i 10 – 30 μm GVS ved dråbe overførselsmetoden, og GVS indeholdende bakterieceller blev immobiliseret på en understøttet membran på et glas substrat. Vores metode er nyttig til at observere real-time vækst af enkelte bakterier inde i GVs. Vi dyrkede Escherichia coli (E. coli) celler som en model inde i GVS, men denne metode kan tilpasses andre celletyper. Vores metode kan anvendes inden for videnskab og industri inden for mikrobiologi, biologi, bioteknologi og syntetisk biologi.
Introduction
Kulturen af bakterieceller på enkelt celleniveau har fået stigende opmærksomhed. Dyrkning af bakterieceller på enkelt celleniveau inde i et lukket rum kan belyse bakterielle funktioner som fænotypiske variabilitet1,2,3,4, celle adfærd5, 6 , 7 , 8 , 9og antibiotikaresistens10,11. På grund af de seneste fremskridt inden for kultur teknikker, kan kulturen af enkelte bakterier opnås inde i et lukket rum, såsom i en brønd-chip4,7,8, gel dråbe12,13 og vand-i-olie (W/O) dråbe5,11. For at fremme forståelsen eller udnyttelsen af enkelte bakterieceller er der behov for yderligere tekniske udviklinger af dyrkningsteknikker.
Vesikler, der efterligner den biologiske celle membran er sfæriske rum bestående af amphifilic molekyler og kan holde forskellige materialer. Vesikler klassificeres efter størrelse og omfatter små vesikler (SVs, diameter < 100 nm), store vesikler (LVs, 1 μm). SVs eller LVs er almindeligt anvendt som lægemiddelbærere på grund af deres affinitet til den biologiske celle membran14. GVs er også blevet brugt som et reaktor system til opførelse af protoceller15 eller kunstige celler16. Indkapsling af biologiske celler i GVS er blevet rapporteret17,18, og dermed GVS viser potentiale som et cellekultursystem, når det kombineres med reaktor systemet.
Her, sammen med en video af eksperimentelle procedurer, vi beskriver, hvordan GVs kan bruges som nye celle-kultur fartøjer19. GVS indeholdende bakterier blev lavet af dråbe Transfer metode20 og blev derefter immobiliseret på en understøttet membran på et cover glas. Vi brugte dette system til at observere bakterievækst på enkelt celleniveau inde i GVs i realtid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en metode til dyrkning af bakterieceller på enkelt celleniveau i GVs. Denne enkle metode indebærer at danne GVS indeholdende bakterieceller på enkelt celleniveau ved hjælp af dråbe overførselsmetoden. Sammenlignet med andre tilgange til opnåelse af GVs indeholdende bakterieceller, denne metode har to fordele: (i) det er let at udvikle, og (II) en lille mængde (2 μL) af prøven opløsning er nødvendig for at forberede GVs. Dråbe overførings metoden20 til klargøring af …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af et førende initiativ for fremragende unge forskere (LEADER, nr. 16812285) fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi (MEXT) i Japan, et tilskud-i-støtte til unge videnskabsmænd forskning (no. 18K18157, 16K21034) fra Japan Society for fremme af videnskab (JSPS) til M.M., og tilskuds-in-Aid fra MEXT til K.K. (nr. 17H06417, 17H06413).
Materials
| Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Cover glass (18 × 18 mm) | Matsunami Glass Ind. | C018181 | thickness 0.13–0.17 mm |
| Cover glass (30 × 40 mm) | Matsunami Glass Ind. | custom-order | thickness 0.25–0.35 mm |
| Desktop centrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | swing rotor type |
| Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Glass vial | AS ONE | 6-306-01 | Durham fermentation tube |
| Glucose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Microscopic heating stage system | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Mineral oil | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Objective lens | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids | 610005 | pore size 100 nm |
| sCMOS camera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| Sodium chloride | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Ultrasonic bath | AS ONE | ASU-3D | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212750 | |
| 0.6 mL lidded plastic tube | Watson | 130-806C | |
| 1.5 mL lidded plastic tube | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
| 1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
Referências
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
- Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
- Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
- Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
- Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).
- Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).
- Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
- Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. Synthesizing life. Nature. 409, 387-390 (2001).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
- Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
- Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
- Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
- Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
- Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024 (2018).
- Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564 (2018).
