Målretting Alpha Synuclein aggregater i hud perifere nerve fibre av fri-flytende Immunofluorescence analysen

Summary

Her presenterer vi en protokoll for en frittflytende indirekte immunofluorescence analysen på huden biopsi seksjoner som gjør det mulig for identifisering av sykdom spesifikke konformasjon varianter av Alpha synuclein involvert i Parkinsons sykdom og flere proteiner av perifere nervesystemet.

Abstract

Hittil, for de fleste nevrodegenerative sykdommer bare en post-obduksjon histopathological definitive diagnosen er tilgjengelig. For Parkinsons sykdom (PD), avhenger diagnosen fortsatt bare på kliniske tegn på motor involvering som vises senere i Sykdomsforløpet, når de fleste av de dopaminerg neurons er allerede tapt. Derfor er det et sterkt behov for en biomarkør som kan identifisere pasienter i begynnelsen av sykdommen eller risikoen for å utvikle den. I løpet av de siste årene, hud biopsi har vist seg å være en utmerket forskning og diagnostisk verktøy for perifere nerve sykdommer som små fiber nevropati. Interessant, en liten fiber nevropati og Alpha synuclein (αSyn) nevrale innskudd har blitt vist av huden biopsi i PD pasienter. Faktisk har huden biopsi den store fordelen av å være en lett tilgjengelig, minimalt invasiv og smertefri prosedyre som gjør at analysen av perifere nervøse vev utsatt for patologi. Videre kan muligheten for å gjenta huden biopsi i løpet av oppfølgingen av den samme pasienten studerer langsgående korrelasjon med sykdomsprogresjon. Vi setter opp en standardisert pålitelig protokoll for å undersøke tilstedeværelsen av αSyn aggregater i hudens nervefibre av PD pasienten. Denne protokollen innebærer noen korte fiksering trinn, en cryotome snitting og deretter en frittflytende immunofluorescence dobbel farging med to spesifikke antistoffer: anti protein Gene Product 9,5 (PGP 9.5) for å markere hud nervefibre og anti 5G4 for å oppdage αSyn aggregater. Det er en allsidig, følsom og lett å utføre protokollen som også kan anvendes for å målrette andre proteiner av interesse i huden nerver. Evnen til å merke αSyn aggregater er et skritt videre til bruk av hud biopsi som et verktøy for å etablere en pre-obduksjon histopathological diagnose av PD.

Introduction

Skin biopsi har fått en stor betydning som diagnostiske og forskning verktøy innen nevrologiske lidelser¹. Faktisk, epidermis og dermis inneholder rikelig somatiske sensoriske nervefibre (myelinated og unmyelinated), nociceptive frie nerve avslutninger, sensoriske reseptorer og autonome innervasjon av svette kjertler, fartøy, talgkjertler og muskel arrector pilorum ²i det.

I midten av 20^th århundre, oppsettet for IMMUNHISTOKJEMI av PGP 9.5 antistoff tillot bevis for en omfattende innervasjon av menneskelig epidermis pattedyr hud³. PGP 9.5 er en kar bok syl-Hydrolase like fordelt langs axons av både det sentrale og perifere nervesystemet (PNS). Tilgjengeligheten av dette antistoff tillot ikke bare å avklare morfologi og anatomi av PNS i huden, men også implementert studiet av sykdommer knyttet til den^3,4. Hud biopsi bidro til å definere en ny klinisk enhet: den lille fiber nevropati. Flere internasjonale grupper demonstrerte foreningen mellom tap av intraepidermal nervefibre og symptomer/tegn på liten fiber nevropati⁵ av huden biopsi analyse og gitt standardiserte protokoller for nerve morphometry samt normative referanseverdier som skal brukes i klinisk praksis^6,7,8.

Nylig en stor mengde bevis har vist at nevrodegenerative sykdommer, karakterisert ved misfolded protein ansamlinger i sentralnervesystemet, er multi-system patologi⁹. Faktisk er PD preget av αSyn akkumulering i den dopaminerg Nevron av substantia Nigra, men det har blitt demonstrert at αSyn og patologisk form, fosforylert ΑSyn (P-αSyn), kunne oppdages også i perifere vev. Gastro-intestinal mucosa¹⁰, spyttkjertler¹¹, huden autonome fibre rundt svette kjertler og pilomotor muskler^12,13,14, Vis immunoreactivity til patogene former for αSyn, i samsvar med Braak hypotese som intriguingly postulatet at αSyn patologi kan begynne i PNS i god tid, før akkumulering i hjernen¹⁵. Videre, tilstedeværelsen av p-αSyn har blitt demonstrert i huden nerver av pasienter med REM atferd lidelser som anses prodromal PD^16,17 dermed huden patologisk αSyn kan betraktes som en lovende tidlig perifer histopathological markør for synucleinopathy.

Foreningen av små fiber nevropati i PD har blitt demonstrert tidligere, og det har blitt funnet at intraepidermal nervefibre tetthet reflekterer sykdomsprogresjon^18,19. Derfor er huden biopsi et nyttig verktøy for å studere neurodegeneration i PD og for å etablere en pre-obduksjon histopathological diagnose av sykdommen. Faktisk, hud biopsi har en stor fordel av å være en lett tilgjengelig og minimalt invasiv prosedyre, slik at analysen av nervøse vev utsatt for patologi. Til slutt, muligheten for å gjenta huden biopsi i løpet av oppfølging av de samme pasientene kan studere langsgående korrelasjon med sykdomsprogresjon.

I vårt laboratorium, utnytte en dobbel Immuno-farging med PGP 9.5 og konformasjon spesifikke monoklonale 5G4 antistoff, som gjenkjenner sykdom spesifikke former for αSyn inkludert små aggregater^20,21, kunne vi vise tilstedeværelsen av αSyn aggregater i huden nerver med en lovende høy diagnostisk effektivitet¹⁹. Immunofluorescence analyse av huden biopsi i conformational sykdommer skiller seg ut som en lovende kilde til biomarkører ved å kombinere både påvisning av protein aggregater og mål på neurodegeneration in vivo. Heretter illustrerer vi en enkel og allsidig protokoll om håndtering av huden biopsi og utføre fri-flytende immunofluorescence farging for å oppdage αSyn aggregater. Videre kan denne protokollen bli tilpasset for å målrette andre protein av interesse uttrykt i huden PNS.

Følgende studie protokoll har blitt brukt til å evaluere diagnostisk nytte av aggregert αSyn analyse i PNS av PD av huden biopsi¹⁹. Inkludering kriterier for PD var: en klar klinisk diagnose i henhold til UK Brain bank diagnostiske kriterier, sykdom varighet minst 3 år, ingen slektshistorie, og ingen større kognitiv svekkelse eller store dysautonomic symptomer i historien. Utelukkelse kriterier ble kjent årsaker til nevropati (glykosylert hemoglobin, kreatinin, vitamin B12, TSH, serum immun fikserings, HIV, HCV, syfilis, og borreliose). Hvert emne gjennomgikk 3 mm-diameter hud biopsier på tre anatomiske områder (halsen på C8 dermatomal nivå, lår 10 cm over kneet, etappe 10 cm over lateral Malleolus) på siden, som var klinisk mer berørt. Generelt, er følgende protokoll om håndtering av huden biopsi og utføre fri-flytende immunofluorescence farging og analyse. Derfor kan det tilpasses og brukes for påvisning av andre proteiner av interesse for hud vev.

Protocol

Protokollen er godkjent av kantonale etikk komité og alle registrerte ga skriftlig informert samtykke til studiet. 1. Skin biopsi Collection La en kvalifisert lege utføre huden biopsi i en hensiktsmessig klinisk setting. Velg området for å utføre huden biopsi og rengjør den med en alkoholserviett. Forbered bedøvelse løsning med 1 cc av lidokain 2%. Med nålen parallelt med området, injisere lokal anestesi subkutant. Etter å ha sjekket…

Representative Results

Etter beskrevet prosedyre (figur 1), oppdaget vi αSyn aggregater, merket med 5G4 antistoff, i dermal nerve bunter innervating autonome strukturer av PD pasienter. Morfologi av Alpha-synuclein avleiringer vises som et prikket signal langs axons av dermal nerver (figur 2). Faktisk, ved å utnytte denne protokollen i 19 PD pasienter og 17 kontroller i huden biopsier på tre anatomiske området (cervical, lår og det som kan være på beina) fant vi at 5G4 hadde 81…

Discussion

Vi beskriver en fri-flytende immunofluorescence analysen for hud biopsier for diagnostisering av PD: den utnytter dobbelt immunostaining med anti-PGP 9.5 antistoff, en panaxonal markør, og anti-5G4, en konformasjon bestemt antistoff som anerkjenner aggregert form av αSyn.

De store fordelene med hud biopsi for diagnostiske formål i PD og muligens i andre protein conformational lidelser er: 1) direkte tilgang til nervøs vev utsatt for sykdom ved en mildt invasiv teknikk og dermed med en forv…

Materials

5G4 (anti human αSyneclein 5G4)	Analytik Jena Roboscreen	847-0102004001	Mouse monoclonal
AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG	Invitrogen	1971418	2mg/ml
AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG	Invitrogen	1922849	2mg/ml
Disodium hydrogen phosphate solution	Merk Millipore	106586
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
L-Lysine monohydrochloride	Sigma-Aldrich	L5626
Paraformaldehyde	Aldrich Chemistry	441244
PGP9.5	Abcam	ab15503	Rabbit polyclonal
Sodium Chloride	Sigma	S3014
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate	Merck Millipore	106346
Sodium (meta)periodate	Sigma-Aldrich	S1878
Trizma Base	Sigma	T1503
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	Mounting medium