Dirigido a agregados de alfa sinucleína en fibras nerviosas periféricas cutáneas por el ensayo de inmunofluorescencia de flotación libre
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de inmunofluorescencia indirecta de flotación libre en secciones de biopsia de piel que permite la identificación de variantes de conformación específicas de la enfermedad de la sinucleína alfa implicadas en la enfermedad de Parkinson y múltiples proteínas de la sistema nervioso periférico.
Abstract
Hasta la fecha, para la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas sólo se dispone de un diagnóstico definitivo histopatológico post mortem. Para la enfermedad de Parkinson (PD), el diagnóstico todavía se basa sólo en los signos clínicos de afectación motora que aparecen más adelante en el curso de la enfermedad, cuando la mayoría de las neuronas dopaminérgicas ya se han perdido. Por lo tanto, existe una fuerte necesidad de un biomarcador que pueda identificar a los pacientes al comienzo de la enfermedad o a riesgo de desarrollarla. En los últimos años, la biopsia de piel ha demostrado ser una excelente herramienta de investigación y diagnóstico para enfermedades de los nervios periféricos como la neuropatía de fibra pequeña. Curiosamente, una pequeña neuropatía de fibra y depósitos neuronales alfa de sinucleína (Syn) se han demostrado mediante biopsia de piel en pacientes con DP. De hecho, la biopsia de piel tiene la gran ventaja de ser un procedimiento fácilmente accesible, mínimamente invasivo e indoloro que permite el análisis de tejido nervioso periférico propenso a la patología. Además, la posibilidad de repetir la biopsia de piel en el curso del seguimiento del mismo paciente permite estudiar la correlación longitudinal con la progresión de la enfermedad. Creamos un protocolo estandarizado y confiable para investigar la presencia de agregados de Syn en las fibras nerviosas de la piel del paciente con DP. Este protocolo implica algunos pasos cortos de fijación, un corte criotomo y luego una doble tinción de inmunofluorescencia flotante con dos anticuerpos específicos: anti Protein Gene Product 9.5 (PGP9.5) para marcar las fibras nerviosas cutáneas y anti 5G4 para detectar Agregados de Syn. Es un protocolo versátil, sensible y fácil de realizar que también se puede aplicar para apuntar a otras proteínas de interés en los nervios de la piel. La capacidad de marcar los agregados de La sinción es otro paso adelante en el uso de la biopsia de piel como herramienta para establecer un diagnóstico histopatológico premortem de DP.
Introduction
La biopsia de piel ha adquirido una gran importancia como herramienta de diagnóstico e investigación en el campo de los trastornos neurológicos1. De hecho, la epidermis y la dermis contienen abundantes fibras nerviosas sensoriales somáticas (mielinizadas y no mielinizadas), terminaciones nerviosas libres nociceptivas, receptores sensoriales e inervación autonómica de glándulas sudoríparas, vasos, glándulas sebáceas y arrector muscular pilorum 2.
A mediados del siglo XX, la configuración de la inmunohistoquímica del anticuerpo PGP9.5 permitió la evidencia de una extensa ertración de la piel de mamífero de epidermis humana3. PGP9.5 es una hidrolasa carboxilo-terminal distribuida equitativamente a lo largo de los axones del sistema nervioso central y periférico (PNS). La disponibilidad de este anticuerpo permitió no sólo aclarar la morfología y anatomía del PNS en la piel, sino que también implementó el estudio de enfermedades asociadas a él3,4. La biopsia de piel contribuyó a definir una nueva entidad clínica: la neuropatía de fibra pequeña. Varios grupos internacionales demostraron la asociación entre la pérdida de fibras nerviosas intraepidérmicas y los síntomas/signos de la neuropatía de fibra pequeña5 mediante el análisis de biopsia de piel y proporcionaron protocolos estandarizados para la morfometría nerviosa, así como valores de referencia normativaqueales que se utilizarán en la práctica clínica6,7,8.
Recientemente una gran cantidad de evidencia ha demostrado que las enfermedades neurodegenerativas, caracterizadas por acumulacionesde proteínas mal plegadas en el sistema nervioso central, son patologías multisistema 9. De hecho, la DP se caracteriza por la acumulación de Sinyn en la neurona dopaminérgica de la sustancia nigra,pero se ha demostrado que el syn y su forma patológica, fosforilado sinyn (P-Syn), podrían ser detectados también en los tejidos periféricos. Mucosa gastro-intestinal10, glándulas salivales11, fibras autonómicas de la piel que rodean las glándulas sudoríparas y los músculos pilomotor12,13,14, muestran inmunorreactividad a las formas patógenas de la sinía, en de acuerdo con la hipótesis de Braak de que intrigantemente postular que la patología de La Sinis puede comenzar en PNS con mucha antelación, antes de su acumulación en el cerebro15. Además, se ha demostrado la presencia de p-Syn en los nervios de la piel de pacientes con Trastornos del Comportamiento REM que se consideran PD16prodrómico,17 por lo tanto patológico de la piel – Syn puede ser considerado un prometedor periférico temprano periférico marcador histopatológico de la sinucleinopatía.
La asociación de la neuropatía de fibra pequeña en la DP se ha demostrado previamente y se ha encontrado que la densidad de las fibras nerviosas intraepidémicas refleja la progresión de la enfermedad18,19. Por lo tanto, la biopsia de piel es una herramienta útil para estudiar la neurodegeneración en PD y para establecer un diagnóstico histopatológico premortem de la enfermedad. De hecho, la biopsia de piel tiene una gran ventaja de ser un procedimiento fácilmente accesible y mínimamente invasivo, permitiendo el análisis de tejido nervioso propenso a la patología. Finalmente, la posibilidad de repetir la biopsia de piel en el curso del seguimiento de los mismos pacientes permite estudiar la correlación longitudinal con la progresión de la enfermedad.
En nuestro laboratorio, explotando una doble inmuno-mancha con PGP9.5 y el anticuerpo monoclonal 5G4 específico de la conformación, que reconoce las formas específicas de la enfermedad de Syn incluyendo pequeños agregados20,21, pudimos mostrar el presencia de agregados de la piel con una alta eficiencia diagnósticaprometedora 19. El análisis de inmunofluorescencia de la biopsia de piel en enfermedades conformacionales destaca como una fuente prometedora de biomarcadores al combinar tanto la detección de agregados proteicos como la medida de la neurodegeneración in vivo. A partir de ahora, ilustramos un protocolo fácil y versátil sobre el manejo de la biopsia de piel y la realización de la tinción de inmunofluorescencia flotante para detectar agregados de Syn. Además, este protocolo se puede adaptar para atacar cualquier otra proteína de interés expresada en el PNS de la piel.
El siguiente protocolo de estudio se ha utilizado para evaluar la utilidad diagnóstica del análisis agregado de Syn en el PNS de la DP mediante biopsia de piel19. Los criterios de inclusión para la DP fueron: un diagnóstico clínico definitivo de acuerdo con los criterios de diagnóstico del Banco del Cerebro del Reino Unido, duración de la enfermedad al menos 3 años, sin antecedentes familiares y sin deterioro cognitivo importante o síntomas disautonómicos importantes en la historia. Los criterios de exclusión eran causas conocidas de neuropatía (hemoglobina glicada, creatinina, vitamina B12, TSH, inmunofijación sérica, VIH, VHC, sífilis y borreliosis). Cada sujeto se sometió a biopsias cutáneas de 3 mm de diámetro en tres sitios anatómicos (cuello a nivel dermatómico C8, muslo 10 cm por encima de la rodilla, pierna 10 cm por encima del maléolo lateral) en el lado, que fue clínicamente más afectado. En general, el siguiente protocolo trata de manejar la biopsia de piel y realizar la tinción y análisis de inmunofluorescencia flotante. Por lo tanto, se puede adaptar y utilizar para la detección de otras proteínas de interés en el tejido de la piel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Describimos un ensayo de inmunofluorescencia flotante para biopsias de piel para el diagnóstico de DP: explota la inmunomancha doble con anticuerpo anti-PGP9.5, un marcador panaxonal y anti-5G4, un anticuerpo específico de conformación que reconoce la forma agregada de Syn.
Las grandes ventajas de la biopsia de piel con fines diagnósticos en DP y posiblemente en otros trastornos de la conformación de proteínas son: 1) el acceso directo al tejido nervioso propenso a la enfermedad mediante…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Parkinson Schweiz y ABREOC (el Consejo Asesor de Investigación Científica del Ente Ospedaliero Cantonale) por su apoyo financiero a este estudio.
Materials
| 5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
| AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2mg/ml |
| AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2mg/ml |
| Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
| Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |
Referências
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