Este protocolo demonstra as metodologias para um modelo do rato do ferimento de cérebro traumático do abrir-crânio e a transplantação de pilhas células-derivadas pluripotentes induzidas humanas cultivadas no local da lesão. Os testes comportamentais e histologic dos resultados destes procedimentos são descritos igualmente em breve.
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Artigo de método
Modelo de impacto cortical controlado da lesão cerebral do rato com transplantação terapêutica de células neurais pluripotentes induzidas humanas da pilha de haste
Neste artigo
Resumo
Resumo
A lesão cerebral traumática (TCE) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. A patologia da doença devido ao TBI progride do insulto mecânico preliminar aos processos secundários da lesão, incluindo o apoptose e a inflamação. A modelagem animal tem sido valiosa na busca de desvendar os mecanismos de lesão e avaliar potenciais terapias neuroprotetoras. Este protocolo descreve o modelo de impacto cortical controlado (CCI) de TBI focal, de cabeça aberta. Especificamente, os parâmetros para produzir um ferimento cortical unilateral suave são descritos. As conseqüências comportáveis do CCI são analisadas usando o teste da remoção da fita adesiva da integração sensorimotor bilateral. A respeito da terapia experimental para a patologia de TBI, este protocolo igualmente ilustra um processo para transplantar pilhas cultivadas no cérebro. As culturas de pilha neural derivadas das pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) foram escolhidas para seu potencial mostrar a restauração funcional superior em pacientes humanos de TBI. A sobrevivência crônica de hiPSCs no tecido cerebral do rato do anfitrião é detectada usando um processo immunohistochemical modificado de DAB.
Introdução
A lesão cerebral traumática (TCE) é um termo geral para a lesão adquirida no cérebro devido a forças mecânicas indiretas (aceleração/desaceleração rotacional ou contra-golpe) de golpes na cabeça ou dano direto de objetos ou ondas de explosão. Estima-se que a TBI seja a causa de aproximadamente 9% das mortes mundiais e observada em uma estimativa de 50 milhões casos por ano1,2. Um relatório 2017 dos centros de controle e prevenção de doenças estimou que, em 2013, houve um total de 2,8 milhões visitas hospitalares e óbitos por TBI nos Estados Unidos3. Muitos TBIs mais leves não são relata....
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Protocolo
Todos os experimentos descritos neste protocolo foram revisados e aprovados pelo Comitê de cuidados e uso de animais universitários da Uniformed Services.
1. craniectomia e impacto cortical controlado
- Preparação do dispositivo de impacto cortical controlado e suprimentos cirúrgicos.
- Coloque uma seringa de 1 mL de ponta de deslizamento com 0,5 mL de soro fisiológico estéril para irrigação de feridas. Coloque uma agulha de 25 G na seringa para controlar a irrigação.
- Prepare uma solução diluir de CsA no DMSO à concentração final de 1 mg/mL. Carregue uma segunda seringa de 1 mL com ponta de deslizamento com 0,5 mL d....
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Resultados
A cirurgia da craniectomia facilita a lesão cerebral experimental e a transplantação terapêutica da pilha: o modelo de impacto cortical controlado de ferimento de cérebro e a terapia subseqüente da transplantação da pilha exigem a remoção cuidadosa do crânio sobrejacente. A craniectomia pode ser realizada em qualquer superfície dorsal do crânio para permitir manipulações para a região cerebral de interesse. O diagrama na Figura 1 retrata um esquema craniectomy de 5 mm de diâ.......
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Discussão
CCI leve como um sistema modelo para testar a terapia regenerativa experimental
O modelo CCI é uma ferramenta valiosa para investigar mecanismos de disfunção tecidual após lesão mecânica no córtex. A tunabilidade dos parâmetros de ferimento é uma característica atrativa deste modelo. Alterando a profundidade Z de impacto, a velocidade, ou tempo de permanência pode aumentar ou diminuir a severidade da lesão conforme desejado pelo investigador10,25
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do centro de neurociência e medicina regenerativa (CNRM, número de subvenção G170244014). Agradecemos a assistência de Mahima Dewan e clara Selbrede em estudos piloto de remoção de adesivos. Kryslaine Radomski realizou lesões cerebrais preliminares e cirurgias de transplante de células. Amanda Fu e Laura Tucker do laboratório central de estudos pré-clínicos do USU CNRM forneceram conselhos valiosos sobre cirurgias animais e testes de comportamento, respectivamente.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Seringas de 1 ml | Becton Dickinson (BD) | ||
| tubos de ensaio flip top de 1,7 ml | Seringa Denville | C2170 | |
| de 10 microlitros | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Agulhas de seringa Precision Glide | Becton Dickinson (BD) | ||
| 70% de etanol | Produto de escolha; varia de acordo com a região | ||
| suspensão oral de paracetamol | Tylenol (Infantil) | Diluir para 1 mg/ml em | |
| vaporizador anestésico | Vetland | 521-11-22 | |
| pano | Compra na loja de departamentos | ||
| Betadine | Purdue Produtos | NDC-67618-151-32 | |
| oxigênio | Produto de escolha; varia de acordo com a região | ||
| ciclosporina A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| DAB kit de coloração | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| dimetil sulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| anticorpo IgG anti-rato de burro, HRP conjugado | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| fita isolante | 3M Corporation | Compra em loja de departamentos | |
| pinças finas | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| fórceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| pipetas capilares de vidro, 1 mm OD, 0,58 mm ID | Kit de | 1B100F-3 | |
| Foredom Electric Co. | K.1070 - K.107018 | ||
| Conjunto de 5 Fresas Micro Ideal para Micro Ponto | Celular Científico | 60-1000 | |
| Impact One Impactor Estereotáxico para CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
| isoflurano | Temporizadores de bancada de laboratório Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Fisher Scientific | 14-649-17 | ||
| MicroData | Instruments, Inc. | PMP-102 | Qualquer extrator será suficiente |
| Microscópio lamínulas | Fisherbrand | 12-545-E | |
| Microscópio slide meio | de escolha | ||
| espelho | Compra de loja de departamentos | ||
| rato anti-humano anti-humano anticorpo de antígeno nuclear | Millipore | MAB1281 | |
| Mouse on Mouse blocking kit | Vector Laboratórios | BMK-2202 | |
| suporte de agulha hemostático | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| pomada oftálmica | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| tesoura de mola oftálmica | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| caixa | Compre em uma loja de departamentos | ||
| cilindro | Compre na loja de departamentos | ||
| Bomba de seringa motorizada QSI | Stoelting | 53311 | |
| Encaixe de compressão de agulha removível | Hamilton | 55750-01 | |
| estrutura estereotáxica para pequenos roedores | Tesoura pequena Stoelting | 51925 | |
| Fine | Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | ||
| Almofadas de preparação de álcool estéril | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| cotonetes estéreis/Kendall Q-tips | Tyco Healthcare | 540500 | |
| Solução salina estéril | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| Cronômetros (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Superfrost Plus Gold lâminas de microscópio | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| suturas - 5.0 seda com agulha curva | Oasis | MV-682 |
Referências
- Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
- Murray, C. J., et al.
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Reimpressões e permissões
