Kontrolliertes kortikales Wirkungsmodell der Maushirnverletzung mit therapeutischer Transplantation von humaninduzierten Pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuralzellen
Summary
Dieses Protokoll zeigt Methoden für ein Mausmodell der traumatischen Hirnverletzung mit offenem Schädel und die Transplantation kultivierter, humaninduzierter pluripotenter Stammzellen-abgeleiteter Zellen in die Verletzungsstelle. Verhaltens- und histologische Tests der Ergebnisse dieser Verfahren werden ebenfalls kurz beschrieben.
Abstract
Traumatische Hirnverletzungen (TBI) sind weltweit eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität. Krankheitspathologie aufgrund von TBI entwickelt sich von der primären mechanischen Beleidigung zu sekundären Verletzungsprozessen, einschließlich Apoptose und Entzündung. Tiermodellierung war wertvoll bei der Suche nach Verletzungsmechanismen und Bewertung potenzieller neuroprotektive Therapien. Dieses Protokoll beschreibt das Modell der kontrollierten kortikalen Wirkung (KII) des fokalen, offenen TBI. Insbesondere werden Parameter für die Herstellung einer leichten einseitigen kortikalen Verletzung beschrieben. Die Verhaltensfolgen von CCI werden mit dem Klebebandentfernungstest der bilateralen sensorimotorischen Integration analysiert. In Bezug auf die experimentelle Therapie für TBI-Pathologie, dieses Protokoll zeigt auch einen Prozess für die Transplantation kultivierter Zellen in das Gehirn. Neuronale Zellkulturen, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) gewonnen wurden, wurden aufgrund ihres Potenzials ausgewählt, eine überlegene funktionelle Wiederherstellung bei menschlichen TBI-Patienten zu zeigen. Chronisches Überleben von HiPSCs im Hirngewebe der Wirtsmaus wird mit einem modifizierten DAB-Immunhistochemischen Prozess nachgewiesen.
Introduction
Traumatische Hirnverletzungen (TBI) sind ein allgemeiner Begriff für die erworbene Schädigung des Gehirns aufgrund von indirekten mechanischen Kräften (Rotationsbeschleunigung/Verzögerung oder Gegenputsch) durch Schläge auf den Kopf oder direkte Schäden durch Objekte oder Explosionswellen. TBI ist schätzungsweise die Ursache von etwa 9 % der weltweiten Todesfälle undwurde in schätzungsweise 50 Millionen Fällen pro Jahr 1,2beobachtet. Ein Bericht der Centers for Disease Control and Prevention aus dem Jahr 2017 schätzte, dass es im Jahr 2013 insgesamt 2,8 Millionen Krankenhausbesuche und Todesfälle aufgrund von TBI in den Vereinigten Staatengab 3. Viele mildere TBIs werden jedes Jahr nicht gemeldet. Seriöses TBI kann zu lebenslanger Beeinträchtigung der Kognition, der motorischen Funktion und der allgemeinen Lebensqualität führen. Die Folgen von mildem TBI, insbesondere repetitives sportbezogenes TBI, wurdenerst vor kurzem für ihre heimtückischen gesundheitlichen Auswirkungen 4,5geschätzt.
Die präklinische Modellierung ist ein wesentlicher Bestandteil der Entwicklung neuer mechanistischer Erkenntnisse und einer möglichen restaurativen Therapie für TBI. Das Modell der kontrollierten kortikalen Schlagwirkung (CCI) von TBI ist ein Open-Head-Modell der mechanischen Prellung des Kortex. Die Aufprallparameter können geändert werden, um CCI-Verletzungen zu erzeugen, die von leichten bis schweren6reichen. CCI-Verletzungen sind eher fokal als diffus, wie bei anderen geschlossenen Kopfmodellen von TBI zu sehen ist. CCI kann durchgeführt werden, um eine einseitige Verletzung zu induzieren, so dass der kontralaterale Kortex als interner Vergleich dienen kann. Dieses Protokoll zeigt die Eigenschaften einer milden CCI für einen Teil des Kortex, der primäre somatosensorische und motorische Regionen umfasst. Dieser kortikale Bereich wurde für seine Beteiligung an sensorimotorischen Verhaltensweisen ausgewählt, für die zahlreiche Verhaltenstests verletzungsbedingte Defizite erkennen können7. Auch Verhaltensverbesserungen durch therapeutische Eingriffe bei TBI können nachgewiesen werden.
Ein Kennzeichen von TBI ist die weit verbreitete neuronale Dysfunktion in der verletzten Region. Verletzte Neuronen erleiden den Zelltod, und die neuronale Netzwerkkonnektivität ist gestört8,9. TBI stört die Rekrutierung endogener Stammzellen, was zu weiteren nachgelagerten Verhaltensdefiziten10,11führt. Die Transplantation von neuronalen Stammzellen und Stammzellen-abgeleiteten Zellen wurde als Möglichkeit zur Wiederherstellung der Funktion im verletzten Gehirn untersucht. Zusätzlich zu dem Potenzial, beschädigte neuronale Schaltkreise wiederherzustellen, üben transplantierte Zellen parakrine Effekte aus, die das neuronale Überleben und die funktionelle Erholung von TBI12fördern. Eine Vielzahl von Zelltypen wurden präklinisch transplantiert, um ihr restauratives Potenzial in Modellen neurologischer Erkrankungen13,14,15zu bewerten. Die jüngste Popularisierung der induzierten pluripotenten Stammzelltechnologie16 hat die Entwicklung zahlreicher menschlicher Stammzelllinien für den experimentellen Einsatz erleichtert. Präklinische Tests mit hiPSC-abgeleiteten Zellen sind ein wichtiger erster Schritt, um die potenzielle therapeutische Wirksamkeit einer bestimmten Zelllinie gegen menschliche Krankheiten zu charakterisieren. Dieses Labor hat Protokolle zur Unterscheidung von HiPSCs zu neuralen Phänotypen17 entwickelt, um transplantierbare Zellen zu erhalten, um die Erholung von traumatischen Hirnverletzungen zu unterstützen.
Experimente in diesem Protokoll verwenden eine einseitige CCI, um TBI in die linke somatosensorische und motorische Kortex von erwachsenen Mäusen zu induzieren. Eine leichte CCI-Verletzung führt zu einem anhaltenden funktionellen Defizit im rechten Vorderpfau, das verwendet wird, um die Auswirkungen der von hiPSC abgeleiteten neuronalen Zelltransplantation auf die funktionelle Wiederherstellung zu verfolgen. Die senkpermittelmotorische Prüfung in diesem Protokoll wurde an die von Bouet und Kollegen18 festgelegte Methodik angepasst und zuvor von Fleming und Kollegen19demonstriert. Dieses Protokoll skizziert einen vollständigen Workflow für die Durchführung einer experimentellen Hirnverletzung, therapeutische Transplantation von HiPS-Zellen und Verhaltens- und histologische Analysen experimenteller Ergebnismessungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mildes CCI als Modellsystem zur Erprobung experimenteller regenerativer Therapie
Das CCI-Modell ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung von Mechanismen der Gewebefunktionsstörung nach mechanischen Verletzungen des Kortex. Die Abstimmbarkeit der Verletzungsparameter ist ein attraktives Merkmal dieses Modells. Die Änderung der Z-Tiefe des Aufpralls, der Geschwindigkeit oder der Verweilzeit kann die Schwere der Verletzung erhöhen oder verringern, wie vom Prüfer gewünscht10</su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Zentrums für Neurowissenschaften und Regenerative Medizin (CNRM, Fördernummer G170244014) unterstützt. Wir schätzen die Unterstützung von Mahima Dewan und Clara Selbrede bei Pilotstudien zur Klebeentfernung. Kryslaine Radomski führte vorläufige Hirnverletzungen und Zelltransplantationen durch. Amanda Fu und Laura Tucker vom USU CNRM Preclinical Studies Core Laboratory gaben wertvolle Ratschläge zu Tieroperationen bzw. Verhaltenstests.
Materials
| 1 ml syringes | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
| 1.7 ml flip top test tubes | Denville | C2170 | |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide syringe needles | Becton Dickinson (BD) | 305122 | |
| 70% ethanol | Product of choice; varies by region | ||
| acetaminophen oral suspension | Tylenol (Children's) | Dilute to 1 mg/ml in water | |
| anesthetic vaporizer | Vetland | 521-11-22 | |
| animal handling cloth | Purchase from department store | ||
| Betadine | Purdue Products | NDC-67618-151-32 | |
| compressed oxygen | Product of choice; varies by region | ||
| cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| DAB staining kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| electrical tape | 3M Corporation | Purchase from department store | |
| fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-3 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom Electric Co. | K.1070 – K.107018 | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Scientific | 60-1000 | |
| Impact One Stereotaxic Impactor for CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
| isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| lab bench timers | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Micropipette puller | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | Any puller will suffice |
| Microscope cover slips | Fisherbrand | 12-545-E | |
| Microscope slide mounting medium | Product of choice | ||
| mirror | Purchase from department store | ||
| mouse anti-human nuclear antigen antibody | Millipore | MAB1281 | |
| Mouse on Mouse blocking kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| needle holder hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| ophthalmic ointment | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| ophthalmic spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| plastic box | Purchase from department store | ||
| plastic cylinder | Purchase from department store | ||
| QSI motorized syringe pump | Stoelting | 53311 | |
| Removable needle compression fitting | Hamilton | 55750-01 | |
| small rodent stereotaxic frame | Stoelting | 51925 | |
| small scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | A1110501 | |
| Sterile alcohol prep pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| sterile cotton swabs/Kendall Q-tips | Tyco Healthcare | 540500 | |
| Sterile saline | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| Stopwatches (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Superfrost Plus Gold microscope slides | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| sutures – 5.0 silk with curved needle | Oasis | MV-682 |
Referências
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