JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Environment

Måling af de potentielle satser for dissimilatorisk nitratreduktion til Ammonium baseret på 14NH4+/15NH4+ Analyser via Sekventiel konvertering til N2O

Published: October 07, 2020
doi:
10.3791/59562
, , , , , ,
1Department of Biological Sciences, Faculty of Science and Engineering,Chuo University, 2Faculty & Graduate School of Urban Environmental Sciences,Tokyo Metropolitan University, 3Center for Ecological Research,Kyoto University, 4Department of Chemistry, Faculty of Science,Toho University, 5Graduate School of Integrated Arts and Sciences,Hiroshima University

Summary

En række metoder til at bestemme den potentielle DNRA sats baseret på 14NH4+/15NH4+ analyser leveres i detaljer. NH4+ omdannes til N2O via flere trin og analyseres ved hjælp af quadrupole gaskromatografi-massespektrometri.

Abstract

Betydningen af at forstå nitrattens skæbne (NR3−), som er den dominerende N-art, der overføres fra terrestriske til akvatiske økosystemer, har været stigende, fordi den globale kvælstofbelastning er steget dramatisk efter industrialiseringen. Dissimilatoriske nitratreduktion til ammonium (DNRA) og denitrificering er begge mikrobielle processer, der bruger NO3− til respiration. Sammenlignet med denitrificering er der kun i begrænset omfang foretaget kvantitative bestemmelser for DNRA’s aktiviteter. Dette har ført til en utilstrækkelig forståelse af DNRA’s betydning i NR3− transformationer og reguleringsfaktorerne i denne proces. Formålet med dette dokument er at tilvejebringe en detaljeret procedure for måling af den potentielle DNRA-rate i miljøprøver. Kort sagt kan den potentielle DNRA-rate beregnes ud fra den 15N-mærkede ammonium (15NH4+) akkumuleringsrate i 15NO3− tilsat inkubation. Bestemmelsen af de 14NH4+ og 15NH 4+ koncentrationer,der er beskrevet i dette papir, består af følgende trin. For det første udvindesNH 4+ i prøven og fanges på et forsuret glasfilter som ammoniumsalt. For det andet eluteres det fangne ammonium og oxideres til NO3− via persulfatoxidation. For det tredje konverteres NO3− til N2O via en N2O-reduktasedetændig denitrifier. Endelig analyseres den konverterede N2O ved hjælp af et tidligere udviklet firedobbelt gaskromatografi-massespektrometrisystem. Vi anvendte denne metode til salt marsh sedimenter og beregnet deres potentielle DNRA satser, viser, at de foreslåede procedurer giver mulighed for en enkel og hurtigere bestemmelse i forhold til tidligere beskrevne metoder.

Introduction

Den kunstige syntese af kvælstofgødning og dens udbredte anvendelse har i høj grad forstyrret den globale kvælstofcyklus. Det anslås , at overførslen af reaktivt kvælstof fra jordbaserede til kystbaserede systemer er fordoblet siden førindustrielletider 1. En betydelig del af gødningen, der anvendes på et givet felt, vaskes væk fra jorden til floder eller grundvand, primært som NR3− 2. Dette kan forårsage miljøproblemer såsom drikkevandsforurening, eutrofiering og dannelse af hypoxi. NO3− fjernes i vandmiljøer fra eller bevares i økosystemet via biologisk assimilation og forskellige mikrobielle dissimilatoriske processer. Denitrificering og anammox er kendt for at være større mikrobielle fjernelsesprocesser for NO3−. Denitrificering er den mikrobielle reduktion af NO3− til gasformige N-produkter (NO, N2O og N2) kombineret med oxidering af en elektrondonor, såsom organiske stoffer, hvilket reducerer risikoen for ovennævnte problemer. Anammox producerer også N2 fra NO2− og NH4+; derfor fjerner den uorganiske N fra et økosystem. Omvendt arbejder DNRA på at bevare N i et økosystem. det er almindeligt accepteret, at DNRA primært udføres af fermentative bakterier eller chemolithoautotrofiske bakterier, og at de reducerer dissimilatory NO3− til biotilgængelige og mindre mobile NH4+.

Undersøgelser af DNRA er primært blevet udført i marine eller flodmundinger økosystemer, såsom oceaniske eller flodmundinger sedimenter og vand, salt eller brakvand marsh jord, og mangrove jord. Kyst- eller havøkosystemer er vigtige som reservoirer til fjernelse af NO3− fra terrestriske økosystemer, og i tidligere undersøgelser har DNRA vist sig at bidrage over et meget bredt udvalg af NO3− fjernelse (0-99%)3,4,5,6,77,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18.9 Endvidere er eksistensen af DNRA blevet påvist i en lang række miljøer, herunder ferskvandsmiljøer19, rismarkeljord20og skovjord21. Mens disse undersøgelser har vist, at DNRA potentielt kan sammenlignes med denitrificering for NO3− fjernelse, er undersøgelser, der måler DNRA-aktiviteten, stadig meget begrænsede sammenlignet med dem, der måler denitrificering.

DNRA-hastigheden er blevet evalueret ved hjælp af 15N-mærkningsteknikker i forbindelse med dataanalyse via analytiske eller numeriske modeller. En analyseløsning til beregning af DNRA-hastigheden er baseret på stigningen i 15 N-berigelsenaf NH4+ puljen efter tilsætning af 15NO3− som sporstof. kr. N-mærket NO3− tilsættes til en prøve og inkuberes, og DNRA-hastigheden kan derefter beregnes ud fra koncentrations- og isotopforholdsændringerne i NH4+ før og efter en vis periode. I dette dokument beskrives en metode til kvantificering af NH4+koncentrationen og isotopforholdet, som er nødvendigt for at beregne DNRA-hastigheden, i detaljer. Dybest set, den metode, der rapporteres her er en kombination af flere tidligere rapporterede teknikker22,,23,24,25,26 med ændringer føjet til nogle procedurer. Metoden består af en serie på fem komponentprocedurer: 1) inkubation af en miljøprøve med ændring af et stabilt isotopsporingsmiddel, 15NO3−, 2) ekstraktion og nyttiggørelse af NH4+ ved hjælp af en “diffusionsprocedure” med ændringer, 3) persulfatoxidation af NH4+ i prøven bestående af indenlandske NH4+ og 15NH4+ afledt af 15NO3− via DNRA aktivitet, i NO3− og 15NO3−, (4) efterfølgende mikrobiel transformation af NO3− og 15NO3− til N2O-isotopomere via den modificerede denitrifiermetode og (5) kvantificering af N2O-isotopomerne ved hjælp af gaskromatografi-massespektrometri (GC/MS). I det følgende afsnit beskrives først forberedelsen af procedurerne (2) og 4), og derefter beskrives alle fem komponentprocedurer i detaljer.

Protocol

1. Udarbejdelse af en PTFE-kuvert til kvantitativ opfangning af gasformig NH3 Et 25 mm stykke polytetrafluorethylen (PTFE) på en lille plade aluminiumsfolie (ca. 300 mm x 450 mm, aftørret med ethanol). Aske et glasfiberfilter (10 mm i diameter med en porestørrelse på 2,7 μm) ved 450 °C i 4 timer i en lyddæmpeovn. Anskaf glasfiberfilteret lidt over midten af båndets længere akse (Figur 1a). Spot 20 μL af 0,9-mol/L H2SO4 …

Representative Results

De repræsentative resultater, der præsenteres i dette dokument, stammer fra 15N-opsporingsforsøg med saltmarskedimenter. Den samplede saltmose blev nyoprettet i kølvandet på jordskælvet i Great East Japan i 2011 i Moune-området i Kesen-numa by i Miyagi-præfekturet, Japan. I september 2017 blev overfladesedimenter (0-3 cm) indsamlet to steder i de subtidale og tidevandszoner. Først, umiddelbart efter indsamling, sedimentet blev sigtet gennem en 4-mm mesh til at fjerne p…

Discussion

Koncentrations- og isotopforholdet for NH4+ for DNRA-analysen blev kvantificeret ved hjælp af flere metoder. Koncentrationerne og isotopforholdet for NH4+ måles generelt separat. NH4+ koncentrationen måles typisk ved hjælp af koloimetriske metoder , herunder en autoanalyser4,10,15,16,17. Iso…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Naoto Tanaka for at hjælpe med dataindsamling og udvikling af protokollen. Indsamlingen af prøver blev støttet af JSPS KAKENHI Grant Number 17K15286.

Materials

15N-KNO3 SHOKO SCIENCE N15-0197
15N-NH4Cl SHOKO SCIENCE N15-0034
20 mL PP bottle SANPLATEC 61-3210-18 Wide-mouth
Aluminum cap Maruemu 1307-13 No. 20, with hole
Boric acid Wako 021-02195
Centrifuge HITACHI Himac CR21G II
Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector SANSIN INDUSTRIAL IP-12
Disposable cellulose acetate membrane filter ADVANTEC 25CS020AS Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter
Disposable syringe Termo SS-10SZ 10 mL
Disposable syringe Termo SS-01T 1 mL
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) NISSUI PHARMACEUTICAL 5913
Gastight syringe VICI Valco Instruments 4075-15010 Series A-2, 100 µL
GC/MS shimadzu GCMS-QP2010ultra
GF/D Whatman 1823-010 10 mm in diameter
Glass vial Maruemu 0501-06 20 mL
Gray butyl rubber stopper Maruemu 1306-03 No.20-S
H2SO4 Wako 192-04696 Guaranteed Reagent
K2S2O8 Wako 169-11891 Nitrogen and Phosphorus analysis grade
KCl Wako 163-03545 Guaranteed Reagent
KNO3 Wako 160-04035 Guaranteed Reagent
NaOH Wako 191-08625 Nitrogen compounds analysis grade
NH4Cl Wako 017-02995 Guaranteed Reagent
Plastic centrifuge tube ASONE 1-3500-22 50 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens American Type Culture Collection (ATCC) ATCC 13985 Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens
PTFE sealing tape Sigma-Aldrich Z221880 25 mm in width
Reciprocating shaker TAITEC 0000207-000 NR-10
Screw-cap test tube IWAKI 84-0252 11 mL
PTFE-lined cap for test tube IWAKI 84-0262
Tryptic Soy Broth Difco Laboratories 211825
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gruber, N., Galloway, J. N. An Earth-system perspective of the global nitrogen cycle. Nature. 451 (7176), 293-296 (2008).
  2. Galloway, J. N., et al. The Nitrogen Cascade. Bioscience. 53 (4), 341-356 (2003).
  3. Rysgaard, S., Risgaard-Petersen, N., Sloth, N. P., Caumette, P., Castel, J., Herbert, R. Nitrification, denitrification, and nitrate ammonification in sediments of two coastal lagoons in Southern France. Coastal Lagoon Eutrophication and Anaerobic Processes (C.L.E.AN.). Developments in Hydrobiology. 117, 133-141 (1996).
  4. Christensen, P. B., Rysgaard, S., Sloth, N. P., Dalsgaard, T., Schwærter, S. Sediment mineralization, nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord with sea cage trout farms. Aquatic Microbial Ecology. 21, 73-84 (2000).
  5. Tobias, C. R., Anderson, I. C., Canuel, E. A., Macko, S. A. Nitrogen cycling through a fringing marsh-aquifer ecotone. Marine Ecology Progress Series. 210, 25-39 (2001).
  6. An, S. M., Gardner, W. S. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) as a nitrogen link, versus denitrification as a sink in a shallow estuary (Laguna Madre/Baffin Bay, Texas). Marine Ecology Progress Series. 237, 41-50 (2002).
  7. Gardner, W. S., et al. Nitrogen fixation and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) support nitrogen dynamics in Texas estuaries. Limnology & Oceanography. 51 (1), 558-568 (2006).
  8. Preisler, A., et al. Biological and chemical sulfide oxidation in a Beggiatoa inhabited marine sediment. The ISME Journal. 1 (4), 341-353 (2007).
  9. Gardner, W. S., McCarthy, M. J. Nitrogen dynamics at the sediment-water interface in shallow, sub-tropical Florida Bay: why denitrification efficiency may decrease with increased eutrophication. Biogeochemistry. 95 (2-3), 185-198 (2009).
  10. Dong, L. F., et al. Changes in benthic denitrification, nitrate ammonification, and anammox process rates and nitrate and nitrite reductase gene abundances along an estuarine nutrient gradient (the Colne estuary, United Kingdom). Applied and Environmental Microbiology. 75 (10), 3171-3179 (2009).
  11. Koop-Jakobsen, K., Giblin, A. E. The effect of increased nitrate loading on nitrate reduction via denitrification and DNRA in salt marsh sediments. Limnology & Oceanography. 55 (2), 789-802 (2010).
  12. Dong, L. F., et al. Dissimilatory reduction of nitrate to ammonium, not denitrification or anammox, dominates benthic nitrate reduction in tropical estuaries. Limnology & Oceanography. 56 (1), 279-291 (2011).
  13. Fernandes, S. O., Bonin, P. C., Michotey, V. D., Garcia, N., LokaBharathi, P. A. Nitrogen-limited mangrove ecosystems conserve N through dissimilatory nitrate reduction to ammonium. Scientific Reports. 2, 419 (2012).
  14. Behrendt, A., de Beer, D., Stief, P. Vertical activity distribution of dissimilatory nitrate reduction in coastal marine sediments. Biogeosciences. 10 (11), 7509-7523 (2013).
  15. Song, G. D., Liu, S. M., Marchant, H., Kuypers, M. M. M., Lavik, G. Anammox denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in the East China Sea sediment. Biogeosciences. 10 (11), 6851-6864 (2013).
  16. Yin, G., Hou, L., Liu, M., Liu, Z., Gardner, W. S. A novel membrane inlet mass spectrometer method to measure 15NH4+15+ for isotope-enrichment experiments in aquatic ecosystems. Environmental Science & Technology. 48 (16), 9555-9562 (2014).
  17. Zheng, Y., et al. Tidal pumping facilitates dissimilatory nitrate reduction in intertidal marshes. Scientific Reports. 6, 21338 (2016).
  18. Bu, C., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium in the Yellow River Estuary: Rates, Abundance, and Community Diversity. Scientific Reports. 7, 6830 (2017).
  19. Scott, J. T., McCarthy, M. J., Gardner, W. S., Doyle, R. D. Denitrification, dissimilatory nitrate reduction to ammonium, and nitrogen fixation along a nitrate concentration gradient in a created freshwater wetland. Biogeochemistry. 87 (1), 99-111 (2008).
  20. Shan, J., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction Processes in Typical Chinese Paddy Soils: Rates, Relative Contributions, and Influencing Factors. Environmental Science & Technology. 50 (18), 9972-9980 (2016).
  21. Silver, W. L., Herman, D. J., Firestone, M. K. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium in upland tropical forest soils. Ecology. 82 (9), 2410-2416 (2001).
  22. Holmes, R. M., McClelland, J. W., Sigman, D. M., Fry, B., Peterson, B. J. Measuring 15N–NH4+ in marine, estuarine and fresh waters: An adaption of the ammonia diffusion method for samples with low ammonium concentrations. Marine Chemistry. 60 (3-4), 235-243 (1998).
  23. Sigman, D. M., et al. A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater. Analytical Chemistry. 73 (17), 4145-4153 (2001).
  24. Weigand, M. A., Foriel, J., Barnett, B., Oleynik, S., Sigman, D. M. Updates to instrumentation and protocols for isotopic analysis of nitrate by the denitrifier method. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (12), 1365-1383 (2016).
  25. Isobe, K., et al. Analytical techniques for quantifying 15N/14N of nitrate, nitrite, total dissolved nitrogen and ammonium in environmental samples using a gas chromatograph equipped with a quadrupole mass spectrometer. Microbes and Environments. 26 (1), 46-53 (2011).
  26. Miyajima, T., Tanaka, Y., Koile, Y. Determining 15N enrichment of dissolved organic nitrogen in environmental waters by gas chromatography/negative-ion chemical ionization mass spectrometry. Limnology and Oceanography. 3 (3), 164-173 (2005).
  27. Stevens, R. J., Laughlin, R. J., Burns, L. C., Arah, J. R. M., Hood, R. C. Measuring the contributions of nitrification and denitrification to the flux of nitrous oxide from soil. Soil Biology and Biochemistry. 29 (2), 139-151 (1997).
  28. Porubsky, W. P., Velasquez, L. E., Joye, S. B. Nutrient-replete benthic microalgae as a source of dissolved organic carbon to coastal waters. Estuaries and Coasts. 31 (5), 860-876 (2008).
  29. Huygens, D., et al. Mechanisms for retention of bioavailable nitrogen in volcanic rainforest soils. Nature Geoscience. 1 (8), 543-548 (2008).
  30. Rutting, T., Boeckx, P., Muller, C., Klemedtsson, L. Assessment of the importance of dissimilatory nitrate reduction to ammonium for the terrestrial nitrogen cycle. Biogeosciences. 8 (7), 1779-1791 (2011).
  31. Song, B., Lisa, J. A., Tobias, C. R. Linking DNRA community structure and activity in a shallow lagoonal estuarine system. Frontiers in Microbiology. 5, 460 (2014).
  32. Cheng, L., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes in sediments of urban river networks: Spatiotemporal variations and environmental implications. Environmental Pollution. 219, 545-554 (2016).
  33. Lisa, J. A., Song, B., Tobias, C. R., Hines, D. E. Genetic and biogeochemical investigation of sedimentary nitrogen cycling communities responding to tidal and seasonal dynamics in Cape Fear River Estuary. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 167, A313-A323 (2015).
  34. Deng, F. Y., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes and associated contribution to nitrogen removal in sediments of the Yangtze Estuary. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 120 (8), 1521-1531 (2015).
  35. Tiedje, J. M., Zehnder, A. J. B. . Biology of Anaerobic Microorganisms. , 179-244 (1988).
  36. Tiedje, J. M., Sexstone, A. J., Myrold, D. D., Robinson, J. A. Denitrification: ecological niches, competition and survival. Antonie van Leeuwenhoek. 48, 569-583 (1982).
  37. Hardison, A. K., Algar, C. K., Giblin, A. E., Rich, J. J. Influence of organic carbon and nitrate loading on partitioning between dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) and N2 production. Geochimica et Cosmochimica Acta. , 164 (2015).
  38. Sigman, D. M., et al. Natural abundance-level measurement of the nitrogen isotopic composition of oceanic nitrate: an adaptation of the ammonia diffusion method. Marine Chemistry. 57 (3-4), 227-242 (1997).
  39. Risgaard-Petersen, N., Rysgaard, S., Revsbech, N. P. Combined microdiffusion-hypobromite oxidation method for determining nitrogen-15 isotope in ammonium. Soil Science Society of America Journal. 59 (4), (1995).
  40. Gardner, W. S., Bootsma, H. A., Evans, C., John, P. A. S. Improved chromatographic analysis of 15N:14N ratios in ammonium or nitrate for isotope addition experiments. Marine Chemistry. 48 (3-4), 271-282 (1995).

Tags

DNRANitrate ReductionAmmoniumN15 AnalysisN2OGas Chromatography-mass SpectrometryCoastal EcosystemsAquatic EnvironmentsDenitrificationAnammox
check_url/59562?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kuroiwa, M., Fukushima, K., Hashimoto, K., Senga, Y., Sato, T., Katsuyama, C., Suwa, Y. Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O. J. Vis. Exp. (164), e59562, doi:10.3791/59562 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image