Her presenteres en kvantitativ sann tids polymerase kjede reaksjons BAS ert protokoll for fastsettelse av det opprinnelige mikro-RNA-innholdet (absolutt/relativ) av lipoprotein-partikler. I tillegg er en metode for å øke Micro-RNA nivå, samt en metode for å bestemme den cellulære opptaket rate av lipoprotein partikler, demonstrert.
Lipoprotein partikler er hovedsakelig transportører av lipider og kolesterol i blodet. Videre inneholder de små mengder av tråder av Noncoding microRNA (miRNA). Generelt endrer miRNA protein uttrykks profilen på grunn av interaksjoner med Messenger-RNA (mRNA). Således, kunnskap av det slektning og absolutt miRNA innhold av lipoprotein partikler er vesentlige å anslå den Biological bevirke av Cellular partikkel opptak. Her er en kvantitativ sanntids polymerase kjedere reaksjon (qPCR)-basert protokoll presentert for å bestemme den absolutte miRNA innholdet av lipoprotein partikler-et eksempel vist for innfødte og miRNA-beriket lipoprotein partikler. Den relative miRNA innholdet er kvantifisert bruker multiwell mikrovæskebasert array kort. Videre denne protokollen tillater forskere å anslå mobilnettet miRNA og dermed lipoprotein partikkel opptak rate. En betydelig økning av mobilnettet miRNA nivå er Observer når du bruker high-density lipoprotein (HDL) partikler kunstig lastet med miRNA, mens inkubasjons med innfødte HDL partikler gir ingen signifikant effekt på grunn av deres ganske lav miRNA innhold. I kontrast, mobilnettet opptaket av lav tetthet lipoprotein (LDL) partikler-verken med innfødte miRNA eller kunstig lastet med det-ikke endre mobilnettet miRNA nivå.
Lipoprotein partikler er sammensatt av en monolag av amfifile lipider og kolesterol omslutter en kjerne av cholesteryl estere og triglyserider fett. Hele partikkel er stabilisert av membran-embedded Apolipoproteins, som definerer partikkel biologiske funksjonalitet. Lipoprotein partikler kan skilles i henhold til deres respektive økende tetthet og dermed synkende størrelse, nemlig som svært lav tetthet lipoprotein (VLDL), middels-density lipoprotein (IDL), LDL, og HDL-partikler. Til tross for transport av vann-uløselig komponenter i blodet, det har blitt demonstrert at HDL partikler bære Noncoding tråder av miRNA1,2. Mikro-RNAs er en klasse av korte (vanligvis to dusin nukleotider) RNA tråder, som brytes ned intracellulært komplementære mRNA tråder og dermed endre uttrykket profilen til visse proteiner3,4,5, 6i den. Videre endringer av miRNA profilen har blitt funnet i en rekke sykdommer og dermed profilen er aktuelt som en biomarkør for diagnostisering og prognose. Den ekstracellulære transport av miRNAs mellom celler via lipoprotein partikler kan tjene som en ekstra mekanisme for intercellulære mRNA nivå moduleringshjul. Å kvantitativt anslå biologisk effekt, kunnskap om den absolutte og relative miRNA innholdet av lipoprotein partikler er nødvendig.
Kvantitativ sann tids PCR er en passende og relativt rask metode for å få denne informasjonen. Således, det slektning kvantifisering (RQ) salgsverdi kan beregnet, og slektning forskjellene imellom annerledes eksemplar og lipoprotein brøk er estimable. Multiwell mikrovæskebasert array kort er en rask og enkel å bruke metode for å bestemme den relative tilstedeværelsen (tilsvarer RQ verdi) av miRNAs i en prøve. Multiwell mikrovæskebasert array-kort består av 96 eller 384 individuelle reaksjons kamre for individuelle qPCR-reaksjoner som er innebygd i en mikrovæskebasert enhet. Hvert kammer inneholder den nødvendige hydrolyse sonden og spesifikke qPCR primere for en individuell miRNA. Fordelene er en kort håndteringstid på grunn av standardisering, en enkel arbeidsflyt, og et redusert antall pipettering trinn. Videre er det nødvendige prøvevolumet minimert. I motsetning til den relative kvantifisering, den absolutte miRNA innholdet krever en sammenligning av qPCR sample resultater med standard kurver av kjente absolutte antall miRNA tråder. Det bør bemerkes at, på grunn av deres relativt lave miRNA innhold, standard og dessuten selv enkelt-molekylet sensitive Imaging teknikker er ikke gjennomførbart-den kunstige berikelse av lipoprotein partikler med miRNA er uunngåelig å studere mobilnettet lipoprotein partikkel interaksjon og miRNA overføring. Når det gjelder dette, delipidation av HDL-partikkel etterfulgt med påfølgende relipidation7 tillater inkorporering av og dermed berikelse med miRNA tråder. Lignende berikelse av LDL-partikler med miRNA er ikke gjennomførbart på grunn av hydrofobisiteten av apoB-100 protein, som er den viktigste bestanddel av LDL partikkel. Men, ved tilsetning av Polar løsemiddel dimethyl sulfoxide (DMSO), som er i stand til å trenge lipid membraner, kan LDL partikler være kunstig lastet med miRNA tråder også.
High-Speed Atomic Force mikroskopi (HS-AFM) er et kraftig verktøy for karakterisering av biologiske prøver som tilbyr subnanometer romlig og subsecond Temporal oppløsning8. Derfor er det en godt egnet teknikk for kvalitetskontroll av modifiserte lipoprotein partikler som innfødt/rekonstituert/merket lipoprotein partikler kan bli avbildet under en nær fysiologiske miljø.
Her, en qPCR-basert protokoll presenteres steg-for-trinn for å bestemme absolutt/relativ miRNA innholdet i lipoprotein partikler og celleprøver, som tillater en estimering av mobilnettet lipoprotein partikkel opptak rate. Videre er en metode for berikelse av lipoprotein partikler med miRNA demonstrert. Denne metoden kan tilpasses for den generelle manipulering av lipoprotein innhold og dermed demonstrerer anvendelsen av lipoprotein partikler som mål for narkotika levering.
Her beskrives isolasjonen av lipoprotein partikkel fraksjoner fra humant blod og fastsettelse av deres individuelle miRNA innhold trinn for trinn. Det er viktig å arbeide i et RNase-fritt miljø mens håndtering isolert og syntetisert miRNA-partikkel-embedded miRNA er åpenbart skjermet fra enzymatisk degradering. Som miRNA/partikkel ratio av innfødte lipoprotein partikler er ganske lav, kunstig berikelse med miRNA er nødvendig for å studere Holo partikkel opptaket av celler. Derved er rekonstituering av HDL-partikler som beskrevet tidligere7 modifisert til å innlemme miRNA tråder. I tillegg separasjon av lipid og protein brøkdel i denne prosedyren gjør det mulig for forskere å undersøke lipid-og protein-tilknyttede komponenter i lipoprotein partikkel19. På en lignende måte, er merkings prosedyren av LDL-partikler tilpasset. Interessant, tillegg av spermin-en naturlig stabilisator av nukleotider-ikke påvirke den miRNA/partikkel ratio. Det bør bemerkes at, i prinsippet, tillater metoden infolding av andre stoffer enn miRNA innenfor en lipoprotein partikkel. Selvfølgelig, det er en grense med hensyn til den fysiske størrelsen på stoffet basert på den totale størrelsen på HDL (diameter: 5-12 NM) og LDL partikler (diameter: 18-25 NM).
Når det gjelder kvalitetskontroll av rekonstituert/merket lipoprotein partikler, HS-AFM er en anvendelig metode for å karakterisere HDL/LDL partikler på enkelt partikkel nivå. I forhold til EM, gir det for kortere Forberedelses tider og nær fysiologiske forhold (våt, romtemperatur).
På grunn av sin iboende følsomhet og forsterkning, er qPCR metoden for valg for å oppdage lav miRNA konsentrasjoner. Alternativt, enkelt-molekyl følsom fluorescens mikroskopi, som er i stand til å oppdage selv individuelle molekyler, ville ikke være egnet på grunn av den lave konsentrasjoner av for eksempel fluorescensmerkete merket miRNA tråder per partikkel. Dermed forholdet mellom miRNA tråder per native lipoprotein partikkel er funnet å være 10-8. Kunstig berikelse øker forholdet med en faktor på 10 000, som forenkler estimering av Cellular lipoprotein opptaket rate (ingen signifikant forskjell oppdages ved hjelp native lipoprotein partikler 19). Den høye følsomheten til qPCR gjør det mulig å fastslå dette opptaket rate ved å måle antall miRNA tråder etter inkubasjonstid og miRNA/partikkel ratio. Det bør bemerkes at den beregnede verdien ignorerer cellulær degradering og frigjøring av miRNA og dermed representerer minst en nedre grense for lipoprotein partikkel opptak ratio.
I fremtiden kan metoden tilpasses til å overføre farmasøytiske stoffer (spesielt også lipofile seg) i celler og relatere deres biologiske effekten til intracellulære konsentrasjon (bestemmes via opptaket rate av lipoprotein partikler).
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av den østerrikske Science Fund Project P29110-B21, “Hochschuljubiläumsstiftung der Stadt Wien Zur Förderung der Wissenschaft” Project H-3065/2011, det europeiske fondet for regional utvikling (EFRE, IWB2020), den føderale staten Upper Østerrike, og “land OÖ Basisfinanzierung”.
Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP | Lipoprotein isolation |
Ultracentrifuge rotor | Beckman | TI 55.2 | Lipoprotein isolation |
Vacutainer (EDTA) | Becton Dickinson | 366643 | Lipoprotein isolation |
Kaliumbromid | Sigma Aldrich | 2110 | Lipoprotein isolation |
Ultracentrifuge tubes | Beckman | 342414 | Lipoprotein isolation |
Ultracentrifuge tube sealer | Beckman | 342428 | Lipoprotein isolation |
Sodiumchlorid | Carl Roth GmbH | P029.2 | Lipoprotein isolation |
EDTA | Fisher Scientific | D/0650/50 | Lipoprotein isolation |
Dialysis tubes, MWCO 12 – 14k | Spectra | 132700 | Lipoprotein isolation |
synthetic miRNA | microSynth | – | synthetic miRNA |
TRIS buffer pH 7 | Ambion | AM9850G | synthetic miRNA |
TRIS buffer pH 8 | Ambion | AM9855G | synthetic miRNA |
sterile tubes | Carl Roth GmbH | ENE8.1 | synthetic miRNA |
Photometer | Eppendorf | Eppendorf Biophotometer | Bradford assay |
Cuvette | Carl Roth GmbH | XK20 | Bradford assay |
Coomassie G-250 Stain | BioRad GmbH | 161-0786 | Bradford assay |
Sodiumchlorid | Carl Roth GmbH | 3957.1 | Delipitation |
EDTA | Fluka Analytical | 03690-100ML | Delipitation |
TRIS buffer pH 8.0 | Ambion | AM9855G | Delipitation |
Ethanol 100% | AustrAlco | Ethanol Absolut 99.9% | Delipitation |
Diethyl ether | Carl Roth GmbH | 3942.1 | Delipitation |
Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge X3R | Delipitation |
Chloroform | Carl Roth GmbH | 3313.1 | Reconstitution |
Methanol | Carl Roth GmbH | 4627.1 | Reconstitution |
Phosphatidylcholine | Sigma Aldrich GmbH | P3556-25mg | Reconstitution |
Cholesterol oleate | Sigma Aldrich GmbH | C-9253-250mg | Reconstitution |
cholesterol | Sigma Aldrich GmbH | C8667-500mg | Reconstitution |
glass tubes | Carl Roth GmbH | K226.1 | Reconstitution |
spermine | Sigma Aldrich GmbH | S3256-1G | Reconstitution |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer comfort | Reconstitution |
Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich GmbH | 3097-25G | Reconstitution |
Magnetic stir bar | Carl Roth GmbH | 0955.2 | Reconstitution |
100µL micropipettes | Carl Roth GmbH | A762.1 | Reconstitution |
PBS | Carl Roth GmbH | 9143.2 | Dialysis |
Amberlite XAD-2 beads | Sigma Aldrich GmbH | 10357 | Dialysis |
Slide-A-Lyzer casette (cut-off 20 kDa) | Thermo Scientific | 66003 | Dialysis |
Syringe | Braun | 9161406V | Dialysis |
Syringe needle | Braun | 465 76 83 | Dialysis |
EGTA | Carl Roth GmbH | 3054.2 | Labeling of LDL particles |
DMSO | life technologies | D12345 | Labeling of LDL particles |
Atomic Force Microscope | RIBM | SS-NEX | Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles |
Muscovite Mica (V-1 Grade) | Christine Gröpl | G250-1/V1 | Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles |
AFM Cantilever | Nanoworld | USC-F1.2-k0.15 | Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles |
Gwyddion 2.49 | Czech Metrology Institute | http://gwyddion.net | Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles |
Chamber slides, Nunc Lab-Tek | VWR | 734-2122 | Cell culture |
HBSS | Carl Roth GmbH | 9117.1 | Cell culture |
Cell counter | Omni Life Science GmbH | Casy | Cell culture |
miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | miRNA extraction |
Centrifuge | Eppendorf | 5415R | miRNA extraction |
20G needle | Braun | Sterican 465 75 19 | miRNA extraction |
5ml syringe | Becton Dickinson | 309050 | miRNA extraction |
PCR cabinet | Esco | PCR-3A1 | Reverse Transcription |
TaqMan Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4366596 | Reverse Transcription |
Rnase-free water | Carl Roth GmbH | T143 | Reverse Transcription |
0.2 ml tubes | Brand | 781305 | Reverse Transcription |
Centrifuge | Carl Roth GmbH | Microcentrifuge AL | Reverse Transcription |
Thermocycler | Sensoquest | Labcycler | Reverse Transcription |
TaqMan Primer | Thermo Scientific | – | qPCR |
iTaq Universal probe supermix | BioRad GmbH | 1725131 | qPCR |
PCR machine | Corbett | Rotor-Gene RG-6000 | qPCR |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4366596 | TaqMan Array |
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems | 4399966 | TaqMan Array |
TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems | 4391128 | TaqMan Array |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems | 4399933 | TaqMan Array |
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Applied Biosystems | 4440040 | TaqMan Array |
TaqMan Advanced miRNA Human A Cards | Applied Biosystems | A31805 | TaqMan Array |
Nuclease-free water | Thermo Scientific | R0581 | TaqMan Array |
MgCl2 (25mM) | Thermo Scientific | R0971 | TaqMan Array |
TE, pH 8.0 | Invitrogen | AM9849 | TaqMan Array |
7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351405 | TaqMan Array |
TaqMan Array Card Sealer | Applied Biosystems | – | TaqMan Array |