Nisto nós descrevemos um procedimento cirúrgico que mostra como conseguir a ligadura permanente da artéria coronária descendente esquerdo-anterior nos ratos. Este modelo é de grande relevância para investigar a fisiopatologia do infarto do miocárdio e os processos biológicos concomitantes.
O infarto do miocárdio (IM) e as doenças coronarianas agudas estão entre as causas mais proeminentes de morte na população com estilo de vida ocidental. Os modelos murino do Mi com ligadura permanente da artéria coronária descendente esquerda-anterior (Lad) imita pròxima mi nos seres humanos. Os modelos murine se beneficiam da extensa engenharia genética disponível hoje em dia. Aqui nós propor um modelo cirúrgico murino reprodutível do infarction miocárdico pela ligadura coronária permanente do Lad. Nossa técnica compreende a anestesia com cetamina/xilazina que pode ser rapidamente revertida pela administração de um antagonista, intubação sem traqueotomia para ventilação mecânica assistida, ventilação com aplicação de positivo extrínmico pressão expiratória final (PEEP) para evitar o colapso alveolar, um método de toracotomia que limita as lesões cirúrgicas mínimas feitas aos músculos esqueléticos e a inflação pulmonar sem toracentese. Este método é escassamente invasivo, reprodutível e reduz a mortalidade e complicações pós-operatórias.
O infarto agudo do miocárdio (IM) é a expressão mais severa das cardiopatias isquêmicas (DIC). A IHD é a principal causa de morbidades e mortes em todo o mundo, especialmente nos países ocidentais1. Consequentemente, tem um enorme impacto econômico nos sistemas de saúde2. A im caracteriza-se pela oclusão de uma artéria coronária por placa aterosclerótica e subsequente apreensão do fluxo sanguíneo em grandes partes do miocárdio. A falta de suprimento de oxigênio no miocárdio leva à morte isquêmica dos cardiomiócitos. Esta condição patológica desencadeia respostas no tecido ventricular que, em última análise, leva a deficiências nas funções ventriculares, remodelação e insuficiência cardíaca3. A im é uma condição fisiopatológica complexa que envolve múltiplos e intrincados processos biológicos compreendendo morte celular regulada, resposta ao estresse oxidativo, inflamação, cicatrização de feridas, fibrose e remodelação ventricular. Algumas dessas respostas biológicas são modeladas como processos individuais in vitro como liberação induzida por necrose de padrões moleculares associados a danos e respostas inflamatórias associadas4. Esses modelos simplificados são essenciais para a compreensão do IM. No entanto, apenas um modelo in vivo pode fornecer uma imagem realista da complexidade dos processos biológicos engajados em resposta ao im.
Mesmo que os modelos de im em animais maiores como suínos possam se relacionar mais estreitamente com a fisiopatologia humana do IM, o poder dos modelos murinos reside nas possibilidades oferecidas pela engenharia genética que é mais avançada do que em qualquer outra espécie de mamífero. Outros aspectos não-negligenciáveis são o baixo custo relativo e a simplicidade da configuração cirúrgica.
Vale ressaltar que os modelos de isquemia-reperfusão do miocárdio podem apresentar diferentes desfechos do que os modelos de im permanentes. Processos biológicos como o tipo de morte celular engajada, qualidade/amplitude ou cinética de respostas inflamatórias e de cicatrização de feridas no tecido miocárdico podem variar de acordo com o modelo5,6,7. No entanto, este protocolo de oclusão coronária permanente pode ser facilmente adaptado para obter um modelo de isquemia-reperfusão.
Este método é relevante para estudos relacionados à fisiopatologia do im sem reperfusão e permite o monitoramento de processos patológicos ocorridos desde a oclusão coronária (minutos) até a insuficiência cardíaca tardia (semanas) no tecido cardíaco local e sistêmica Níveis.
A primeira etapa crítica deste procedimento é certamente a intubação. Nós usamos a agulha interna Blunted de um cateter de 16 G como um tubo tracheal. Nós não recomendamos usar esta configuração com camundongos que peso inferior a 22 g. Com esta configuração, pode ser difícil intubar os camundongos corretamente com menor peso corporal sem danificar a traquéia. Um outro ponto crítico é limitar incisões feitas ao músculo ao expor a traquéia e o ribcage. Reduzir os danos teciduais é de grande importância, especialmente ao estudar processos inflamatórios subsequentes ao im. É por isso que preferimos a disseminação suave do músculo e costelas com fórceps e retratores8,9. Nós não usamos o cauterizador elétrico para controlar o sangramento10. Isso pode causar queimaduras iatrogênicas e favorecer infecções. Tanto o trauma quanto as infecções podem viés de leitura inflamatória. Aplicação de uma PEEP extrínica de 3 cm H2o mergulhando a exaustão de ventilação em um tubo de água limita o colapso alveolar final expiratório durante a toracotomia. A localização do LAD é outra etapa crítica e deve-se ter em mente que a anatomia das artérias coronárias pode variar dependendo da cepa e do genótipo do mouse11. Exige alguma experiência para visualizar o LAD, porém coloc a sutura diretamente 2-3 milímetros abaixo dos átrios esquerdos como descrito no procedimento deve permitir o posicionamento correto da ligadura. A descoloração instantânea de grandes porções do ventrículo esquerdo a sutura confirma a exatidão. Finalmente, aplicando artificialmente o auto-PEEP bloqueando a exaustão da ventilação para 2-3 ciclos respiratórios durante o fechamento da caixa permite uma hiperinflação transiente do pulmão que ajudará a perseguir o ar da cavidade torácica12. Nós propositadamente não realizamos um toracocentese como mostrado em 9,10. Desta forma, limitamos o risco de lesões pulmonares e cardíacas e evitamos danos ou perfurações excessivas nos tecidos.
A isquemia-reperfusão miocárdica (I/R) é um modelo cirúrgico relacionado que imita a restauração do fluxo sanguíneo coronariano que é feito em pacientes com im em clínicas. Durante o modelo I/R, uma oclusão transitória da artéria coronária é feita apertando um pedaço de tubo no rapaz por uma duração de 20 a 45 min8,10. Em seguida, a oclusão é liberada para permitir a reperfusão do miocárdio para a duração desejada. Esta simples modificação aplicada ao nosso protocolo pode facilmente transformá-lo em um modelo I/R4,8,14,15. O infarto pode ser confirmado por um exame de sangue para a troponina cardíaca T8,10ou pela ecocardiografia15.
MI difere do modelo I/R porque a reperfusão por si só induz uma lesão. A im induz mais necrose tecidual e a apoptose é mais pronunciada no miocárdio reperfused5. A cinética de infiltração de células inflamatórias também é diferente entre em MI e IR com uma infiltração miocárdica tardia de células imunes no MI7. O tamanho e a posição da área infartada também diferirão entre a ligadura permanente e os modelos I/R15. Tendo isso em mente, é preciso ser cauteloso para escolher um modelo relevante, já que os modelos de I/R e de MI permanentes não são equivalentes. Outro modelo murino de infarto do miocárdio é o modelo de crio-infarto. A aplicação de uma sonda criogênica na parede anterior do ve induz o congelamento do tecido ventricular e a parada do fluxo sanguíneo na artéria LAD. Entretanto, essa técnica difere das técnicas de mi e I/R quanto ao tempo e amplitude de remodelação e respostas inflamatórias16,17.
A variabilidade é uma limitação quanto a qualquer procedimento cirúrgico. Essa variabilidade depende de diferenças biológicas. Um bom exemplo é a variação do arranjo arterial coronariano em camundongos11. Ele também se baseia em habilidades de experimentador. Vale ressaltar que a formação adequada dos experimentadores é obrigatória para alcançar resultados estáveis com esse modelo. Um experimentador bem treinado pode facilmente produzir tamanhos de enfarte que são reprodutíveis (Figura 3a-B). A mortalidade do modelo depende da posição do LAD, da duração dos experimentos (dias, semanas), da cepa do camundongo e dos genótipos. Os tipos de drogas anestésicas e analgésicas também podem afetar o desfecho dos experimentos com efeitos de cardioprotetores ou cardiodepressores putativos. Em nossas mãos, este modelo tem uma taxa de mortalidade global de 25-30%. Essa taxa de mortalidade compreende óbitos espontâneos e sacrifícios antes do término do experimento, independentemente das cepas e da duração do experimento. A maioria das mortes ou sacrifícios estão entre o segundo e o quarto dias após a cirurgia. A aplicação de um rigoroso manejo da dor e acompanhamento dos animais pode reduzir a mortalidade.
Aqui nós apresentamos resultados representativos do tamanho do enfarte analisado usando a coloração de TTC e a expressão da proteína e dos genes envolvidos em processos inflamatórios ou fibrótica no LV pelo borrão ocidental e pelo PCR do tempo real respectivamente (Figura 3C-G). Também é possível medir muitos desses parâmetros por meio de ensaios enzimáticos imunoenzimáticos (ELISA). É claro que, de acordo com a hipótese que precisa ser testada, esse método pode ser seguido por qualquer análise funcional por ultrassom, ressonância magnética ou medida de pressão e volume do cateter intraventricular. Também é possível extrair o coração e investigar ainda mais a biologia celular de células cardíacas isoladas. Globalmente, o modelo de IM com ligadura permanente da artéria coronária LAD é particularmente útil para avaliar processos inflamatórios e fibróticos, cicatrização de feridas e alterações na função cardíaca subsequente ao infarto do miocárdio.
The authors have nothing to disclose.
Este modelo foi desenvolvido com o apoio da Swiss National Science Foundation (Grants 310030_162629 to LL) e fundos departamentais dos serviços de cirurgia torácica e medicina intensiva do hospital universitário de Lausanne. JL é beneficiário de uma subvenção da Fundação Emma Muschamp. Reconhecemos o apoio crucial dos veterinários e da equipe de instalação de animais da faculdade de biologia e medicina da Universidade de Lausanne. Agradecemos ao Dr. Giuseppina Milano do serviço de cirurgia cardíaca do hospital universitário de Lausanne e do Dr. Alexandre Sarre da avaliação cardiovascular facilty da Universidade de Lausanne por suas dicas técnicas.
1 CC Syringe, Omnifix-F | B. Braun | 9161406V | |
30G- Needle | BD Microlance 3 | 304000 | |
70% Ethanol | |||
Betadine 60 ml | MundiPharma | ||
Blunt Retractors | Fine Science Tools | 18200-09 | |
Castroviejo Needle Holder Straight with Lock | Roboz | RS-6416 | |
Cotton Swabs | Applimed SA | 6001109 | |
Dissecting Scissors, Curved | Aesculap | BC603R | |
Electrical Razor | Remington | HC720 | |
Glucose 5% B.Braun | B. Braun | 531032 | |
Hair Removal Cream, Veet | Silk & Fresh Tech. | 8218535 | |
Iris Dissecting Forceps Full Curved | Aesculap | OC022R | |
Ketasol 100 (100 mg/ml) | Dr. E. Graeub AG | QN01AX03 | |
Micro Scissors, Curved Blunt/Blunt | Aesculap | FM013R | |
NaCl 0.9% B. Braun | B. Braun | 534534 | |
Short Fixator | Fine Science Tools | 18200-01 | |
Silk Suture 5-0, BB | Ethicon | K880H | |
Silk Suture 6-0, P-1 | Ethicon | 639H | |
Silk Suture 7-0,BV-1 | Ethicon | K804 | |
Student Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
Student Fine Forceps-Angled | Fine Science Tools | 91110-10 | |
Surgical Gloves | Weitacare | 834301 | |
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Temgesic sol 0.3 mg/ml Buprenorphine | Indivior Schweiz AG | N02AE01 | |
Tracheal tube inner needle of an 16G i.v. cat | Abbocath-T | G714-A01 | |
Universal S3 Microscope, OMPIMD | Zeizz | ||
Ventilator, MiniVent Model 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
Viscotears | Alcon | 1551535 | |
Xylasol (1mg/ml) | Dr. E. Graeub AG | QN05CM92 |