在这里,我们描述了一个外科手术,演示如何实现小鼠左前下降冠状动脉的永久结扎。该模型对研究心肌梗死的病理生理学和伴随的生物过程具有十分相关的意义。
心肌梗死(MI)和急性冠心病是西方生活方式人群死亡的最突出原因之一。具有左前下降(LAD)冠状动脉永久结扎的MI的鼠模型与人类MI的紧密模仿。Murine 模型受益于当今广泛的基因工程。在此,我们提出了一种通过永久LAD冠状连接治疗心肌梗死的可重复的小鼠手术模型。我们的技术包括用氯胺酮/西拉津麻醉,可以通过给对手进行快速逆转,无需气管切开进行机械辅助通气,使用外在阳性进行通气最终呼气压力(PEEP),以避免肺泡崩溃,一种胸腔切除术方法,限制对骨骼肌肉的最小手术病变,以及无胸腔的肺膨胀。这种方法具有稀疏侵入性,可重复,可降低术后死亡率和并发症。
急性心肌梗死(MI)是缺血性心脏病(IHD)最严重的表现。IHD是全世界,特别是在西方国家,疾病和死亡的主要原因。因此,它对医疗体系产生了巨大的经济影响。MI的特点是动脉冠状动脉被动脉粥样硬化斑块遮挡,随后在心肌的大部分地区抑制血流。心肌缺氧导致心肌缺血死亡。这种病理状况触发心室组织的反应,最终导致心室功能缺陷,重塑和心力衰竭3。MI 是一种复杂的病理生理学条件,涉及多个复杂的生物过程,包括调节性细胞死亡、对氧化应激的反应、炎症、伤口愈合、纤维化和心室重塑。其中一些生物反应被建模为体外个体过程,如坏死引起的损伤相关分子模式和相关炎症反应释放4。这些简化的模型对于理解 MI 至关重要。然而,只有体内模型才能提供对MI反应的生物过程复杂性的真实图像。
尽管在大型动物(如猪)中的MI模型可能与MI的人类病理生理学有更密切的联系,但鼠模型的力量在于基因工程提供的可能性,这种可能性比任何其他哺乳动物物种都更先进。其他不可忽视的方面是相对低廉的成本和手术设置的简单性。
值得一提的是,心肌缺血再灌注的模型可以表现出与永久MI模型不同的结果。生物过程,如细胞死亡的类型,质量/振幅或动能的炎症和伤口愈合反应在心肌组织可能根据模型5,6,7有所不同。然而,这种永久冠状动脉闭塞方案可以很容易地适应,以获得缺血再灌注模型。
该方法与MI的理疗学相关研究不进行再灌注,允许监测从冠状动脉闭塞(分钟)到晚期心力衰竭(周)在当地心脏组织和全身发生的病理过程水平。
此过程的第一个关键步骤肯定是插管。我们使用16G导管的钝化内针作为气管管。我们不建议将此设置与重量小于 22 g 的小鼠一起使用。有了这个设置,可能很难插管小鼠适当的体重较小,而不损坏气管。另一个关键点是限制肌肉的切口,同时暴露气管和肋骨。减少组织损伤非常重要,尤其是在研究MI之后的炎症过程时。这就是为什么我们更喜欢用钳子和缩回器温和地散开肌肉和肋骨8,9。我们不使用电动烧灼器来控制出血10。这可能导致异体烧伤,并倾向于感染。创伤和感染都可能偏向炎症读出。应用3cm H2O的外在PEEP,将通风废气插入水管,限制胸腔切除术期间最终呼气泡结。LAD的定位是另一个关键步骤,人们应该记住,冠状动脉的解剖结构可能因小鼠11的菌株和基因型而异。它需要一些经验来可视化 LAD,但是,按照程序所述,将缝合线直接放置在左侧牙套下方 2-3 mm,应允许正确定位结扎。缝合线下左心室大部分立即变色,证实了其准确性。最后,人工应用自动PEEP,在胸闭期间阻塞通风排气2-3个呼吸循环,使肺部出现暂时性恶性通货膨胀,这将有助于从胸腔12中追逐空气。我们故意不执行胸腔,如9,10所示。 这样,我们限制肺和心脏受伤的风险,避免过多的组织损伤或穿孔。
心肌缺血再灌注(I/R)是一种相关的手术模型,模仿在诊所对MI患者进行的冠状血流恢复。在I/R模型中,冠状动脉的瞬态闭塞是通过将一根管子拧紧到LAD上,持续20至45分钟8,13。然后释放闭塞,使心肌在所需的持续时间内重新灌注。这种简单的修改应用于我们的协议可以很容易地把它变成I/R模型4,8,14,15。心肌梗死可以通过心脏肌钙蛋白T8、10的血液测试或回声心电图15进行确认。
MI 与 I/R 模型不同,因为再灌注本身会导致损伤。MI诱导更多的组织坏死和凋亡在重新融合心肌5中更为明显。在MI和IR中,炎症细胞渗透的动力学也不同,MI7免疫细胞的心肌渗透延迟。在永久结扎和I/R模型15之间,梗塞区域的大小和位置也会有所不同。请记住,由于 I/R 和永久 MI 模型不等效,因此在选择相关模型时必须谨慎。心肌梗死的另一个动尿模型是低温心肌模型。在LV前壁上应用低温探针可诱导LAD动脉中心室组织和血流抑制的冻结。然而,这种技术不同于MI和I/R技术关于改造和炎症反应的时间和振幅16,17。
变异性是任何外科手术的一个限制。这种变异性依赖于生物差异。一个很好的例子是小鼠11的冠状动脉排列的变化。它还依赖于实验者的技能。值得一提的是,为了达到这一模型的稳定结果,必须对实验者进行适当的培训。训练有素的实验者可以很容易地产生可重现的梗塞尺寸(图3A-B)。模型的死亡率取决于LAD的位置、实验的持续时间(天、周)、小鼠菌株和基因型。麻醉和镇痛药物的类型也可能影响具有假定性心脏保护或心抑郁作用的实验结果。在我们手中,这种模式的全球死亡率为25-30%。亡率包括实验结束前的自发死亡和牺牲,无论菌株和实验持续时间如何。大多数死亡或牺牲是在手术后的第二天和第四天之间。对动物实行严格的疼痛管理和随访可以降低死亡率。
在这里,我们介绍使用TTC染色和表达蛋白质和基因在LV中分别由西方印迹和实时PCR参与的炎症或纤维化过程的梗塞大小代表性的结果(图3C-G)。也可以通过酶连结免疫吸附测定(ELISA)或酶测定法测量许多这些参数。当然,根据需要测试的假设,这种方法可以遵循任何功能分析,通过超声波,MRI或室内导管测量压力和体积。也可以提取心脏,并进一步研究分离细胞的心脏细胞生物学。总体而言,具有LAD冠状动脉永久结扎的MI模型对于评估炎症和纤维化过程、伤口愈合和心肌梗死后心脏功能的变化特别有用。
The authors have nothing to disclose.
该模型是在瑞士国家科学基金会(310030_162629 至 LL)和洛桑大学医院胸外科和重症监护医学服务部门资助下开发的。JL是艾玛·穆尚基金会的赠款。我们感谢洛桑大学生物和医学学院的兽医和动物设施工作人员的重要支持。我们感谢洛桑大学医院心脏外科服务的朱塞皮娜·米兰诺博士和洛桑大学心血管评估中心亚历山大·萨雷博士的技术提示。
1 CC Syringe, Omnifix-F | B. Braun | 9161406V | |
30G- Needle | BD Microlance 3 | 304000 | |
70% Ethanol | |||
Betadine 60 ml | MundiPharma | ||
Blunt Retractors | Fine Science Tools | 18200-09 | |
Castroviejo Needle Holder Straight with Lock | Roboz | RS-6416 | |
Cotton Swabs | Applimed SA | 6001109 | |
Dissecting Scissors, Curved | Aesculap | BC603R | |
Electrical Razor | Remington | HC720 | |
Glucose 5% B.Braun | B. Braun | 531032 | |
Hair Removal Cream, Veet | Silk & Fresh Tech. | 8218535 | |
Iris Dissecting Forceps Full Curved | Aesculap | OC022R | |
Ketasol 100 (100 mg/ml) | Dr. E. Graeub AG | QN01AX03 | |
Micro Scissors, Curved Blunt/Blunt | Aesculap | FM013R | |
NaCl 0.9% B. Braun | B. Braun | 534534 | |
Short Fixator | Fine Science Tools | 18200-01 | |
Silk Suture 5-0, BB | Ethicon | K880H | |
Silk Suture 6-0, P-1 | Ethicon | 639H | |
Silk Suture 7-0,BV-1 | Ethicon | K804 | |
Student Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
Student Fine Forceps-Angled | Fine Science Tools | 91110-10 | |
Surgical Gloves | Weitacare | 834301 | |
Surgical heating pad | Personalized setting | ||
Temgesic sol 0.3 mg/ml Buprenorphine | Indivior Schweiz AG | N02AE01 | |
Tracheal tube inner needle of an 16G i.v. cat | Abbocath-T | G714-A01 | |
Universal S3 Microscope, OMPIMD | Zeizz | ||
Ventilator, MiniVent Model 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
Viscotears | Alcon | 1551535 | |
Xylasol (1mg/ml) | Dr. E. Graeub AG | QN05CM92 |