Hierin beschreiben wir ein chirurgisches Verfahren, das zeigt, wie eine dauerhafte Ligation der links-vorderen absteigenden Herzkranzgefäße bei Mäusen erreicht werden kann. Dieses Modell ist von hoher Relevanz für die Untersuchung der Pathophysiologie des Myokardinfarkts und der damit einhergehenden biologischen Prozesse.
Myokardinfarkt (MI) und akute Koronarerkrankungen gehören zu den prominentesten Todesursachen in der Bevölkerung mit westlichem Lebensstil. Die murinen Modelle des MI mit permanenter Ligation der linken vorderen absteigenden (LAD) Koronararterie imitieren MI beim Menschen. Murine-Modelle profitieren von der umfangreichen Gentechnik, die es heute gibt. Hier schlagen wir ein reproduzierbares murinisches chirurgisches Modell des Myokardinfarkts durch permanente LAD-Koronarligation vor. Unsere Technik umfasst Anästhesie mit Ketamin/Xylazin, die durch Verabreichung eines Antagonisten schnell umgedreht werden kann, Intubation ohne Tracheotomie für die mechanisch unterstützte Beatmung, Belüftung mit Anwendung von extrinsischem positivem Endexpiratorischen Druck (PEEP) zur Vermeidung von Alveolarkollaps, eine Thorakotomiemethode, die sich auf die minimalen chirurgischen Läsionen der Skelettmuskulatur beschränkt, und Lungeninflation ohne Thoracentese. Diese Methode ist spärlich invasiv, reproduzierbar und reduziert die Sterblichkeit und Komplikationen nach der Operation.
Akuter Myokardinfarkt (MI) ist der schwerste Ausdruck ischämischer Herzkrankheiten (IHD). IHD sind die Hauptursache für Morbiditäten und Todesfälle weltweit, vor allem in westlichen Ländern1. Folglich hat sie enorme wirtschaftliche Auswirkungen auf die Gesundheitssysteme2. MI ist gekennzeichnet durch die Okklusion einer Koronararterie durch atherosklerotische Plaque und die anschließende Verhaftung des Blutflusses in großen Teilen des Myokards. Mangelnde Sauerstoffversorgung im Myokard führt zum ischämischen Tod von Kardiomyozyten. Dieser pathologische Zustand löst Reaktionen im ventrikulären Gewebe aus, die letztlich zu Mängeln bei ventrikulären Funktionen, Umbau und Herzinsuffizienz führen3. MI ist ein komplexer pathophysiologischer Zustand, der mehrere und komplizierte biologische Prozesse umfasst, die einen regulierten Zelltod, eine Reaktion auf oxidativen Stress, Entzündungen, Wundheilung, Fibrose und ventrikuläre Umgestaltung umfassen. Einige dieser biologischen Reaktionen werden als individuelle Prozesse in vitro wie Nekrose-induzierte Freisetzung von damage-assoziierten molekularen Mustern und damit verbundenen Entzündungsreaktionen modelliert4. Diese vereinfachten Modelle sind für das Verständnis von MI unerlässlich. Allerdings kann nur ein In-vivo-Modell ein realistisches Bild der biologischen Prozesse Komplexität als Reaktion auf MI beteiligt.
Auch wenn Modelle von MI bei größeren Tieren wie Schweinen enger mit der menschlichen Pathophysiologie von MI in Verbindung stehen, liegt die Kraft der murinen Modelle in den Möglichkeiten der Gentechnik, die fortgeschrittener ist als bei jeder anderen Säugetierart. Andere nicht zu vernachlässigende Aspekte sind die relativ niedrigen Kosten und die Einfachheit des chirurgischen Setups.
Es ist erwähnenswert, dass Modelle der Ischämie-Reperfusion des Myokards andere Ergebnisse aufweisen können als permanente MI-Modelle. Biologische Prozesse wie die Art des zelltoten Einsatzes, Qualität/Amplitude oder Kinetik von entzündlichenund Wundheilungsreaktionen im Myokardgewebe können je nach Modell 5,6,7variieren. Dieses Protokoll der permanenten koronaren Okklusion kann jedoch leicht angepasst werden, um ein Ischämie-Reperfusionsmodell zu erhalten.
Diese Methode ist relevant für Studien im Zusammenhang mit der Physiopathologie von MI ohne Reperfusion und ermöglicht die Überwachung pathologischer Prozesse, die von koronaren Okklusion (Minuten) bis spät im Stadium Herzinsuffizienz (Wochen) am lokalen Herzgewebe und systemische Ebenen.
Der erste entscheidende Schritt dieses Verfahrens ist sicherlich die Intubation. Wir verwenden die abgestumpfte Innennadel eines 16 G Katheters als Trachealrohr. Wir empfehlen nicht, dieses Setup mit Mäusen zu verwenden, die weniger als 22 g wiegen. Mit diesem Setup kann es schwierig sein, Mäuse richtig mit kleinerem Körpergewicht zu intubieren, ohne die Luftröhre zu beschädigen. Ein weiterer kritischer Punkt ist die Begrenzung von Einschnitten auf den Muskel, während die Luftröhre und der Brustkorb freigelegt werden. Die Verringerung von Gewebeschäden ist von großer Bedeutung, insbesondere bei der Untersuchung von entzündlichen Prozessen nach MI. Deshalb bevorzugen wir sanfte Streuen von Muskeln und Rippen mit Zangen und Retraktoren8,9. Wir verwenden keinen elektrischen Kauteriser, um Blutungen10zu kontrollieren. Dies kann iatrogene Verbrennungen verursachen und Infektionen begünstigen. Sowohl Traumata als auch Infektionen können entzündliche Ausleseausbrüche voreingenommen. Die Anwendung eines extrinsischen PEEP von 3 cmH2O durch Eintauchen des Lüftungsabgass in ein Wasserrohr begrenzt den endexpauratorischen Alveolarkollaps während der Thorakotomie. Die Lokalisierung von LAD ist ein weiterer kritischer Schritt und man sollte bedenken, dass die Anatomie der Herzkranzgefäße je nach Stamm und Genotyp der Maus variieren kann11. Es erfordert einige Erfahrung, um die LAD zu visualisieren, aber die Naht direkt 2-3 mm unter der linken Vorahnung zu platzieren, wie im Verfahren beschrieben, muss eine korrekte Positionierung der Ligation ermöglichen. Die sofortige Verfärbung großer Teile des linken Ventrikels unter der Naht bestätigt die Genauigkeit. Schließlich ermöglicht die künstliche Anwendung von Auto-PEEP durch Blockierung von Beatmungsauslässen für 2-3 Atemwege während des Brustverschlusses eine vorübergehende Hyperinflation der Lunge, die helfen wird, die Luft aus der Brusthöhle zu jagen12. Wir führen absichtlich keine Thoracentese durch, wie in 9,10gezeigt. Auf diese Weise begrenzen wir das Risiko von Lungen- und Herzerkrankungen und vermeiden übermäßige Gewebeschäden oder Perforation.
Myokardiale Ischämie-Reperfusion (I/R) ist ein verwandtes chirurgisches Modell, das die Wiederherstellung des koronaren Blutflusses imitiert, die MI-Patienten in Kliniken durchgeführt wird. Während des I/R-Modells erfolgt ein vorübergehender Verschluss der Herzkranzgefäßarterie durch Anziehen eines Schlauchstücks auf dem LAD für eine Dauer von 20 bis 45 min8,13. Dann wird die Okklusion freigesetzt, um eine Reperfusion des Myokards für die gewünschte Dauer zu ermöglichen. Diese einfache Änderung, die auf unser Protokoll angewendetwird, kann es leicht in ein I/R-Modell 4,8,14,15verwandeln. Der Infarkt kann durch einen Bluttest auf Herztroponin T8,10 oder durch Echokardiographie15bestätigt werden.
MI unterscheidet sich vom I/R-Modell, da die Reperfusion selbst eine Verletzung auslöst. MI induziert mehr Gewebenekrose und Apoptose ist stärker ausgeprägt in reperfused Myokard5. Die Kinetik der inhetzischen Zellen infiltration unterscheidet sich auch zwischen MI und IR mit einer verzögerten Myokardinfiltration von Immunzellen in MI7. Die Größe und Position des Infarktbereichs unterscheiden sich auch zwischen permanenter Ligation und I/R-Modellen15. Vor diesem Hintergrund muss man vorsichtig sein, ein relevantes Modell zu wählen, da I/R- und permanente MI-Modelle nicht gleichwertig sind. Ein weiteres murines Modell des Myokardinfarkts ist das Kryoinfarktmodell. Die Anwendung einer kryogenen Sonde an der LV-Vorderwand induziert das Einfrieren von ventrikulärem Gewebe und blutdurchflussverhaften in der LAD-Arterie. Diese Technik unterscheidet sich jedoch von MI- und I/R-Techniken in Bezug auf Timing und Amplitude von Remodeling und Entzündungsreaktionen16,17.
Variabilität ist eine Einschränkung wie bei jedem chirurgischen Eingriff. Diese Variabilität beruht auf biologischen Unterschieden. Ein gutes Beispiel ist die Variation der koronaren arteriellen Anordnung bei Mäusen11. Es stützt sich auch auf Experimentierfähigkeiten. Es ist erwähnenswert, dass eine angemessene Ausbildung der Experimentatoren obligatorisch ist, um mit diesem Modell stabile Ergebnisse zu erzielen. Ein gut ausgebildeter Experimentator kann leicht Infarktgrößen herstellen, die reproduzierbar sind (Abbildung 3A-B). Die Sterblichkeit des Modells hängt von der Position des LAD, der Dauer der Experimente (Tage, Wochen), der Mausdehnung und den Genotypen ab. Die Arten von Anästhesie und analgetischen Medikamenten können auch das Ergebnis der Experimente mit vermeintlichen kardioprotektive oder kardiodepressive Wirkung beeinflussen. In unseren Händen hat dieses Modell eine globale Sterblichkeitsrate von 25-30%. Diese Sterblichkeitsrate umfasst spontane Todesfälle und Opfer vor dem Ende des Experiments, unabhängig von Belastungen und Experimentdauer. Die meisten Todesfälle oder Opfer liegen zwischen dem zweiten und vierten Tag nach der Operation. Die Anwendung eines strengen Schmerzmanagements und die Nachverfolgung der Tiere kann die Sterblichkeit senken.
Hier stellen wir repräsentative Ergebnisse der Infarktgröße vor, die mit TTC-Färbung und Expression von Proteinen und Genen analysiert wurden, die an entzündlichen oder fibrotischen Prozessen in LV durch Western Blot bzw. Real-Time PCR beteiligt sind (Abbildung 3C-G). Es ist auch möglich, viele dieser Parameter durch enzymgebundenen Immunsorbent Assay (ELISA) oder enzymatische Assays zu messen. Natürlich kann diese Methode gemäß der zu prüfenden Hypothese jede funktionelle Analyse durch Ultraschall, MRT oder intraventrikuläre Kathetermessung von Druck und Volumen durchführen. Es ist auch möglich, Herz zu extrahieren und die Herzzellbiologie an isolierten Zellen weiter zu untersuchen. Insgesamt ist das MI-Modell mit permanenter Ligation der LAD-Herzkranzgefäßarterie besonders nützlich, um entzündliche und fibrotische Prozesse, Wundheilung und Veränderungen der Herzfunktion nach Myokardinfarkt zu bewerten.
The authors have nothing to disclose.
Dieses Modell wurde mit Unterstützung des Schweizerischen Nationalfonds (Grants 310030_162629 to LL) und Abteilungsfonds aus den Diensten der Thoraxchirurgie und Intensivmedizin des Universitätsspitals Lausanne entwickelt. JL erhält ein Stipendium der Emma Muschamp Foundation. Wir würdigen die entscheidende Unterstützung von Tierärzten und Mitarbeitern der Fakultät für Biologie und Medizin der Universität Lausanne. Wir danken Dr. Giuseppina Milano vom Service für Herzchirurgie des Universitätsspitals Lausanne und Dr. Alexandre Sarre von cardiovascular assessment Facilty der Universität Lausanne für ihre technischen Hinweise.
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