यूरीन हेमाटोपोएटिक स्टेम और संतति कोशिकाओं और एमएल-AF9 प्रेरित ल्यूकेमिया में Mitochondrial प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के प्रवाह Cytometric विश्लेषण
Summary
हम murine स्वस्थ hematopoietic स्टेम और संतति कोशिकाओं (HSPCs) और ल्यूकेमिया कोशिकाओं घातक माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) द्वारा संचालित के एक माउस मॉडल से mitochondrial प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) का पता लगाने के लिए मल्टीपैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करने के लिए एक विधि का वर्णन MLL-AF9.
Abstract
हम विभिन्न लाइव अस्थि मज्जा में mitochondrial ROS का विश्लेषण करने के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्रिक दृष्टिकोण प्रस्तुत (बीएम) व्युत्पन्न स्टेम और स्वस्थ चूहों से संतति सेल आबादी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एएमएल के साथ चूहों MLL-AF9 द्वारा संचालित. विशेष रूप से, हम एक दो कदम सेल धुंधला प्रक्रिया का वर्णन है, जिससे स्वस्थ या ल्यूकेमिया बीएम कोशिकाओं को पहले एक fluorogenic डाई है कि mitochondrial superoxides का पता लगाता है के साथ दाग रहे हैं, फ्लोरोक्रोम से जुड़े monoclonal एंटीबॉडी है कि उपयोग किया जाता है के साथ धुंधला द्वारा पीछा विभिन्न स्वस्थ और घातक hematopoietic जनक आबादी भेद करने के लिए. हम भी प्राप्त करने और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा नमूनों का विश्लेषण करने के लिए एक रणनीति प्रदान करते हैं। पूरे प्रोटोकॉल 3-4 एच के रूप में कम के रूप में एक समय सीमा में किया जा सकता है। हम भी प्रमुख चर पर विचार करने के लिए के रूप में अच्छी तरह से लाभ और लाइव hematopoietic और ल्यूकेमिया स्टेम और संतति subpopulations प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा फ्लोरोजेनिक रंगों का उपयोग कर के mitochondrial डिब्बे में ROS उत्पादन की निगरानी की सीमाओं पर विचार करने के लिए . इसके अलावा, हम डेटा है कि mitochondrial ROS बहुतायत अलग स्वस्थ HSPC उप जनसंख्या और ल्यूकेमिया संतानों के बीच भिन्न होता है और hematologic अनुसंधान में इस तकनीक के संभावित अनुप्रयोगों पर चर्चा प्रस्तुत करते हैं.
Introduction
प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजाति (आरओएस) आणविक ऑक्सीजन से प्राप्त अत्यधिक प्रतिक्रियाशील अणु हैं। ROS उत्पादन का सबसे अच्छी तरह से परिभाषित सेलुलर स्थान mitochondria है, जहां इलेक्ट्रॉनों कि ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन के दौरान इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ETC) के माध्यम से पारित (OXPHOS) आणविक ऑक्सीजन द्वारा अवशोषित कर रहे हैं एक विशिष्ट के गठन के लिए अग्रणी आरओएस का प्रकार जिसे सुपरऑक्साइड1कहा जाता है। एंजाइमों की एक श्रृंखला के कार्यों के माध्यम से, सुपरऑक्साइड dismutases या SODs कहा जाता है, superoxides हाइड्रोजन पेरोक्साइड में परिवर्तित कर रहे हैं, जो बाद में इस तरह के कैटालेस या glutathione peroxidases (GPX) के रूप में एंजाइमों द्वारा पानी में बेअसर कर रहे हैं। ROS-नियामक तंत्र में क्षोभ ROS के अतिरिक्त उत्पादन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, अक्सर ऑक्सीडेटिव तनाव के रूप में जाना जाता है, जो हानिकारक और संभावित घातक सेलुलर परिणाम जैसे मैक्रो अणु क्षति (यानी, डीएनए, प्रोटीन, लिपिड) है. इसके अलावा, ऑक्सीडेटिव तनाव मधुमेह, सूजन रोगों, उम्र बढ़ने और ट्यूमर2,3,4जैसे कई रोगों से संबंधित है। रेडॉक्स होमियोस्टेसिस को बनाए रखने और ऑक्सीडेटिव तनाव को रोकने के लिए, कोशिकाओं में विभिन्न प्रकार के ROS-नियामक तंत्रहोते हैं 5।
उचित भ्रूणीय और वयस्क हेमेटोपोइसिस6के लिए कुछ आरओएस के शारीरिक स्तर आवश्यक हैं . हालांकि, अतिरिक्त ROS डीएनए क्षति, सेलुलर भेदभाव और hematopoietic स्टेम और संतति पूल की थकावट के साथ जुड़ा हुआ है. वहाँ भी सबूत है कि redox जीव विज्ञान में परिवर्तन ल्यूकेमिया और स्वस्थ कोशिकाओं के बीच अलग हो सकता है. उदाहरण के लिए, ROS स्तर उनके स्वस्थ समकक्षों और अन्य अध्ययनों के सापेक्ष घातक माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) कोशिकाओं में उच्च हो जाते हैं सुझाव दिया है कि ल्यूकेमिया स्टेम कोशिकाओं अस्तित्व के लिए ROS के एक कम स्थिर राज्य स्तर को बनाए रखने7,8. महत्वपूर्ण बात यह है कि इन रेडॉक्स मतभेदों को चिकित्सीय रूप से भुनाने की रणनीतियों ने मानव कैंसर की कई सेटिंग्स9,10में वादा किया है . इसलिए, परख है कि माउस मॉडल में आरओएस के स्तर के आकलन के लिए अनुमति कैसे इन प्रजातियों सेलुलर शरीर क्रिया विज्ञान और रोग रोगजनन के लिए योगदान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संभावित की प्रभावशीलता का आकलन करने के लिए एक मंच प्रदान की हमारी समझ में सुधार हो सकता है उपन्यास redox-लक्ष्यीकरण विरोधी कैंसर चिकित्सा.
Protocol
Representative Results
Discussion
आरओएस का पता लगाने के लिए विकसित किए गए फ्लोरोरोजेनिक रंगों का अक्सर स्थिर कोशिकाओं में माइक्रोस्कोपी या प्रवाह साइटोमेट्री22द्वारा जीवित कोशिकाओं में मूल्यांकन किया जाता है। फ्लो साइटोमे?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम फॉक्स चेस कैंसर सेंटर बोर्ड ऑफ डायरेक्टर्स (DDM), अमेरिकन सोसायटी ऑफ हेमेटोलॉजी स्कॉलर अवार्ड (एसएमएस), अमेरिकन कैंसर सोसायटी आरएसजी (एसएमएस) और रक्षा विभाग (पुरस्कार: W81XWH-18-1-0472) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Heat inactivated FBS | VWR Seradigm LIFE SCIENCE | 97068-085 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific | BP399-20 | Buffer |
| 15 mL conical tube | BD falcon | 352096 | Tissue Culture Supplies |
| 50 mL conical tube | BD falcon | 352098 | Tissue Culture Supplies |
| 40 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Tissue Culture Supplies |
| RBC Lysis Buffer | Fisher Scientific | 50-112-9751 | Tissue Culture Supplies |
| Menadione sodium Bisulfite | Sigma aldrich | M5750 | Pro-oxidant |
| NAC | Sigma aldrich | A7250 | Anti-oxidant |
| CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 | Biolegend | 100310 | Antibody |
| CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | Antibody |
| CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | Antibody |
| CD19 PE-Cy5 clone 6D5 | Biolegend | 115510 | Antibody |
| B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | Antibody |
| Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | Antibody |
| Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 | Biolegend | 116210 | Antibody |
| CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 | Biolegend | 103420 | Antibody |
| CD117 APC-Cy7 clone 2B8 | Biolegend | 105825 | Antibody |
| Sca1 peacific Blue clone D7 | Biolegend | 108120 | Antibody |
| CD150 APC clone TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | Antibody |
| CD34 FITC clone RAM34 | BD Bioscience | 553733 | Antibody |
| CD45.2 APC clone 104 | Biolegend | 1098313 | Antibody |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | Dye |
| Mitotracker Green | ThermoFisher Scientific | M7514 | Dye |
| Live/dead Yellow Dye | ThermoFisher Scientific | L34967 | Dye |
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