Flow analytiske analyse av mitokondrie reaktive oksygen arter i murine blodkreft stem og stamceller og MLL-AF9 drevet leukemi
Summary
Vi beskriver en metode for bruk multiparameter Flow flowcytometri å oppdage mitokondrie reaktive oksygen arter (ROS) i murine sunn blodkreft stammen og stamceller (HSPCs) og leukemi celler fra en mus modell av akutt myelogen leukemi (AML) drevet av MLL-AF9.
Abstract
Vi presenterer en flyt analytiske tilnærming for å analysere mitokondrie ROS i ulike Live benmarg (BM)-avledet stilk og Stamcelle populasjoner fra friske mus, samt mus med AML drevet av MLL-AF9. Nærmere bestemt beskriver vi en to-trinns cellefarge prosess, hvorved sunne eller leukemi BM celler er først farget med en fluorogenic fargestoff som oppdager mitokondrie superoxides, etterfulgt av farging med fluorokromkonjugert-koblede monoklonale antistoffer som brukes å skille ulike sunn og ondartet blodkreft stamfar populasjoner. Vi tilbyr også en strategi for å anskaffe og analysere prøvene ved å strømme flowcytometri. Hele protokollen kan utføres i en tidsramme så kort som 3-4 h. Vi kan også markere nøkkelen variabler å vurdere samt fordeler og begrensninger av overvåking ROS produksjon i mitokondrie kupé av levende blodkreft og leukemi stilk og stamfar subpopulasjoner bruker fluorogenic fargestoffer ved flyt flowcytometri . Videre presenterer vi data som mitokondrie ROS overflod varierer blant distinkte sunne HSPC Sub-populasjoner og leukemi forfedre og diskutere mulige anvendelser av denne teknikken i Hematologic forskning.
Introduction
Reaktive oksygen arter (ROS) er svært reaktive molekyler avledet fra molekylær oksygen. Den mest veldefinerte cellulære plasseringen av ROS produksjon er mitokondrier, der elektroner som passerer gjennom elektron transport kjeden (ETF) i løpet av oksidativt fosforylering (OXPHOS) absorberes av molekylær oksygen som fører til dannelsen av en bestemt type ROS kalt superoxides1. Gjennom handlingene til en serie av enzymer, kalt superoxide dismutases eller SODs, superoxides omdannes til hydrogen peroksider, som senere nøytralisert i vann av enzymer som catalase eller glutation peroxidases (GPX). Forstyrrelser i ROS-regulatoriske mekanismer kan føre til overflødig produksjon av ROS, ofte referert til som oksidativt stress, som har skadelige og potensielt dødelige cellulære konsekvenser som Makromolekyl Kader (dvs. DNA, protein, lipider). Videre er oksidativt stress knyttet til flere patologi, slik som diabetes, inflammatoriske sykdommer, aldring og svulster2,3,4. For å opprettholde Redox homeostase og forebygge oksidativt stress, celler har en rekke ROS-regulere mekanismer5.
Fysiologiske nivåer av visse ROS er nødvendig for riktig embryonale og voksne hematopoiesen6. Men, overflødig ROS er forbundet med DNA skade, differensiering og utmattelse av blodkreft stammen og stamfar bassenget. Det er også bevis for at endringer i Redox biologi kan variere mellom leukemi og sunne celler. For eksempel, ros nivåer tendens til å være høyere i akutt myelogen leukemi (AML) celler i forhold til deres sunne kolleger og andre studier har antydet at leukemi stamceller opprettholde en lav steady-state nivå av ros for overlevelse7,8. Viktigere, strategier for terapeutisk utnytte disse Redox forskjellene har vist løftet i flere menneskelige kreft innstillinger9,10. Derfor analyser som gjør det mulig for vurdering av ROS nivåer i musemodeller kan forbedre vår forståelse av hvordan disse artene bidra til cellulær fysiologi og sykdom patogenesen samt potensielt gi en plattform for å vurdere effektiviteten av romanen Redox-målretting anti-kreft terapi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fluorogenic fargestoffer som er utviklet for påvisning av ROS er ofte evaluert i faste celler ved mikroskopi eller i levende celler ved flyt flowcytometri22. Flow analytiske evaluering av mitokondrie ROS i BM celler ved hjelp mitokondrie ROS fluorogenic fargestoffer har to store fordeler: 1) det er en rask og enkel teknikk som er egnet for levende celle analyse og 2) det gir mulighet for å skille og analysere sjeldne populasjoner på ett cellenivå i BM ved hjelp av overflate markør farging. De…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av The Fox Chase Cancer Center styret (DDM), American Society of hematologi Scholar Award (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) og Department of Defense (Award #: W81XWH-18-1-0472).
Materials
| Heat inactivated FBS | VWR Seradigm LIFE SCIENCE | 97068-085 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific | BP399-20 | Buffer |
| 15 mL conical tube | BD falcon | 352096 | Tissue Culture Supplies |
| 50 mL conical tube | BD falcon | 352098 | Tissue Culture Supplies |
| 40 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Tissue Culture Supplies |
| RBC Lysis Buffer | Fisher Scientific | 50-112-9751 | Tissue Culture Supplies |
| Menadione sodium Bisulfite | Sigma aldrich | M5750 | Pro-oxidant |
| NAC | Sigma aldrich | A7250 | Anti-oxidant |
| CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 | Biolegend | 100310 | Antibody |
| CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | Antibody |
| CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | Antibody |
| CD19 PE-Cy5 clone 6D5 | Biolegend | 115510 | Antibody |
| B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | Antibody |
| Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | Antibody |
| Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 | Biolegend | 116210 | Antibody |
| CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 | Biolegend | 103420 | Antibody |
| CD117 APC-Cy7 clone 2B8 | Biolegend | 105825 | Antibody |
| Sca1 peacific Blue clone D7 | Biolegend | 108120 | Antibody |
| CD150 APC clone TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | Antibody |
| CD34 FITC clone RAM34 | BD Bioscience | 553733 | Antibody |
| CD45.2 APC clone 104 | Biolegend | 1098313 | Antibody |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | Dye |
| Mitotracker Green | ThermoFisher Scientific | M7514 | Dye |
| Live/dead Yellow Dye | ThermoFisher Scientific | L34967 | Dye |
Referências
- Dröse, S., Brandt, U. Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).
- Gerber, P. A., Rutter, G. A. The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus. Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).
- Höhn, A., et al. Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence. Redox Biology. 11, 482-501 (2017).
- Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked. Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).
- Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. Redox regulation of cell state and fate. Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).
- Harris, J. M., et al. Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo. Blood. 121, 2483-2493 (2013).
- Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias. Blood. 117, 5816-5826 (2011).
- Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
- Di Marcantonio, D., et al. Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia. Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).
- Glasauer, A., Chandel, N. S. Targeting antioxidants for cancer therapy. Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).
- Kalaitzidis, D., et al. mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis. Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).
- Sykes, S. M., et al. AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias. Cell. 146 (5), 697-708 (2011).
- Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment. International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).
- Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).
- Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
- Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow. Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Somervaille, T. C., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
- Hao, X., et al. Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche. Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).
