Этот метод описывает хронический препарат, который позволяет оптический доступ к гиппокампу живых мышей. Этот препарат может быть использован для выполнения продольных оптических изображений нейрональной структурной пластичности и активности вызванных клеточной пластичности в течение нескольких недель.
Двухфотонная микроскопия является фундаментальным инструментом для нейронауки, поскольку она позволяет исследует мозг живых животных на пространственных масштабах, начиная от субклеточного до сетевого уровня и в временных масштабах от миллисекунд до недель. Кроме того, двухфотонная визуализация может быть объединена с различными поведенческими задачами для изучения причинно-следственных связей между функцией мозга и поведением. Однако, у млекопитающих, ограниченное проникновение и рассеяние света ограничили двухфотонные интражизненной визуализации в основном поверхностных областей мозга, тем самым исключая продольные исследования глубоких областей мозга, таких как гиппокамп. Гиппокамп участвует в пространственной навигации и эпизодической памяти и является давней моделью, используемой для изучения клеточных, а также когнитивных процессов, важных для обучения и отзыва, как в области здоровья и болезней. Здесь подробно описан препарат, позволяющий хронический оптический доступ к псальскому гиппокампу у живых мышей. Этот препарат можно комбинировать с двухфотонных оптических изображений при клеточном и субклеточном разрешении в головке фиксированной, обезображенных живых мышей в течение нескольких недель. Эти методы позволяют повторное изображение нейронной структуры или активности вызванных пластичности в десятках до сотен нейронов в пневса гиппокампа CA1. Кроме того, этот хронический препарат может быть использован в сочетании с другими методами, такими как микро-эндоскопия, головная микроскопия широкой поля или трехфотонная микроскопия, тем самым значительно расширяя набор инструментов для изучения клеточных и сетевых процессов в обучении и памяти.
У млекопитающих гиппокамп является ключевой областью мозга для кодирования и отзыва эпизодических воспоминаний,а также для пространственной навигации 1,2,3,4. По этой причине, гиппокамп был – и до сих пор – очень важная модель для изучения основных механизмов, которые позволяют мозгу кодировать и вспомнить воспоминания5,6,7 или для навигации в среде8 ,9 сбор наград и избежать опасностей. Кроме того, формирование гиппокампа является одним из областей мозга, где новые нейроны генерируются на протяжении всей жизни грызунов10,11 и, возможно, людей12,13. Наконец, дегенерация или нарушение формирования гиппокампа связаны с неврологическими и психическими расстройствами, включая болезнь Альцгеймера14.
У мышей гиппокамп расположен примерно на 1 мм ниже поверхности мозга15. Его положение предотвратило оптический доступ в нетронутый мозг и, следовательно, продольные исследования гиппокампа динамики опирались в основном на магнитно-резонансную (Mr) визуализации, электрофизиологии и экс-vivo анализа изображений. Методы мризображения позволяют отслеживать биологические процессы (например, экспрессия генов изменяет16) у одного и того же животного в течение нескольких дней, но не имеют пространственного разрешения для дискриминации отдельных нейронов. Классические электрофизиологические методы in vivo предлагают очень высокое временное разрешение и изысканную чувствительность к изменениям мембранного потенциала. Тем не менее, они имеют ограниченное пространственное разрешение, и они не имеют возможности надежно отслеживать те же клетки в течение более длительных периодов времени. Оптическая визуализация позволяет изучать более разнообразные процессы в силу своих высоких временных и пространственных разрешений. Тем не менее, ex vivo изображений только предоставляет снимки текущих процессов, и, таким образом, он не подходит для продольных исследований, в ходе которых животные узнать и вспомнить информацию.
Оптическая визуализация In vivo сочетает в себе некоторые преимущества МР-изображения и электрофизиологии с преимуществами оптической визуализации. Поэтому он очень хорошо подходит для продольного и корреляционного анализа динамики и поведения мозга мыши. Это имеет отношение к исследованиям биологических процессов с очень быстрыми (миллисекундами до секунд) или очень медленными (от дней до недель) временных масштабах. Примерами таких процессов, которые актуальны для нейробиологии, являются динамика мембранного напряжения, переходные капоты Ca2 ,, клеточная пластичность и структурные изменения, которые, как полагают, очень важны для формирования памяти и отзыва. Различные методы распространились в vivo изображений на дорсальный гиппокамп18,19,20,21,22. Острые препараты позволили отслеживать активность пирамидальных нейронов (PN), а также их дендритов и дендритных шипов в течение нескольких часов20,22. Однако эти временные рамки не позволяют изучить долгосрочные структурные изменения, которые могут лежать в основе поэтапного обучения. Хронические препараты – в сочетании с микроэндоскопами23,24 или с длинными рабочими расстояниями (WD) стандартные цели микроскопа21 – позволили повторно еле-изображения дорсального гиппокампа в течение нескольких Недель.
Здесь мы описываем хронический препарат, который обеспечивает периодический оптический доступ к CA1 подполе содварки гиппокампа живых мышей с помощью постоянно вставленной канюли изображений. Этот препарат позволяет повторно получить доступ к CA1 без функциональных нарушений и подходит для интравитальной двухфотон (2P) или широкоугольной эпифлюоресценции изображения. Подробно описаны два примера 2P глубокой магнитной визуализации в дорсаль-центре CA1 живых мышей: продольная визуализация дендритной структуры и дендритной динамики позвоночника и продольная визуализация пластичности, вызванной активностью. Обсуждаются основные преимущества и ограничения методики.
Здесь описывается процедура повторного 2P изображения дорсального CA1 у живых мышей. После операции мышь обычно восстанавливается в течение 2 дней. Процедура вызывает минимальный астроглиоз26,43. Кровоизлияние и отеки, которые могут последовать за операцией, как правило, повторно адсорбируется в течение 10 до 14 дней. Как правило, начиная с 14 дней после имплантации препарат достаточно ясен для выполнения интравитальная визуализация. Успех операции не зависит от работы в стерильной среде. Тем не менее, очень важно поддерживать высокий уровень гигиены, чтобы избежать осложнений из-за связанных с хирургическим вмешательством инфекций. Это происходит путем тщательной очистки хирургических инструментов до и после операции и путем их теплостерилизацию непосредственно перед каждым использованием (шаг 2.1.1). Оптическая канюля хранится в чистом, стерилизованный контейнер и промывается стерильным сольнием непосредственно перед имплантацией. Выполнение общей хирургической практики дезинфекции рук и очистки хирургической станции также очень важно. Препарат остается стабильным и позволяет клеточного и субклеточного разрешения изображений в течение нескольких недель26,35.
Критические шаги, изменения и устранение неполадок.
Важно очистить внешнюю капсулу до тех пор, пока не будут выставлены самые глубокие волокна. Неспособность разоблачить альвеус может привести к неспособности сосредоточиться на соом PNs, или в уменьшенном разрешении изображения дендритных шипов, при использовании коммерческих целей с 3- или 4-мм WD. Для этой цели полезно очень медленно абляции неокортекса с помощью иглы диаметром 0,9 мм, а затем переключиться на иглу диаметром 0,3-0,5 мм (24-29 калибровочных) для более тонкого контроля всасывания при удалении наиболее престритов. Кроме того, тонкие щипцы могут быть использованы для удаления оставшейся коры после воздействия волокна36.
Кровотечение во время операции может быть проблематичным, так как кровь препятствует обзору. В ожидании сгустка, чтобы сформировать, а затем полоскания сольников, чтобы смыть остаточной крови рекомендуется. Повторите по мере необходимости.
Уютное соответствие между канюлей и краниотомии помогает повысить стабильность препарата, сохраняя канюли на месте перед нанесением цемента, особенно если внешний край канюли заподлицо с черепом. В виду того что размеры сверла трефина и канюли сопрягаются, свободная пригонка может возникнуть из-за неровностей на стороне cannula – которые требуют немножко более больших краниотомии для того чтобы приспосабливать (см. шаг 2.3.14) – или от скачками краниотомии. Любые нарушения канюли должны быть поданы покинуть (шаги 1.3 и 1.12) и трефин должен быть проведен перпендикулярно черепу до тех пор, пока краниотомия не будет завершена (шаг 2.3.12). Удаление трефина из черепа до завершения краниотомии может привести к нерегулярным краниотомии.
Ограничения- Инвазивность и стабильность препарата.
Трудно оценить эффект корковой абляции, так как трудно точно определить области, непосредственно и косвенно затронутые. В целом, операция удаляет часть теменной коры и часть зрительной и задней сенсорной коры21. Абляция коры не имеет прямого проекта к гиппокампа и гиппокампа ткани ни коснулся, ни повреждены. Важно отметить, что было показано, что имплантация изображения канюли не грубо изменить функции гиппокампа и, в частности, гиппокампа зависит от обучения21,36,37,38, 39. Тем не менее, было бы важно количественно в какой степени как канюля и внешняя часть имплантата (пластина держателя головы и зубной акриловой колпачок) являются хроническими стрессорами, оценивая уровень кортикостерона в крови и вес надпочечников по сравнению с неимплантированных мышей.
Препарат обычно остается стабильным от недель до месяцев26. В долгосрочной перспективе, рост кожи и костей, как правило, вытесняют акриловую шапку и увеличить нестабильность подготовки изображений.
Оптические ограничения.
Обычная 2P микроскопия позволяет изображения до 1 мм глубоко в неокортикальной ткани40,41. В соответствии с этим, можно изображение дендритов и дендритных шипов, расположенных в SR(рисунок 2D-F) или SLM36. Тем не менее, изображение через канюли создает ограничения для эффективного NA. Для достижения максимального разрешения диаметр и глубина канюли изображений должны быть сопоставлены с изображением NA, так как меньшие диаметры и большие глубины будут обрезать свет высоких целей NA. Например, при визуализации с целью погружения воды 1.0 NA через канюли длиной 1,6 мм, внутренний диаметр 3,65 мм необходим для поддержания полного NA. Однако, используя канюлю этого диаметра увеличит сжатие гиппокампа и может повлиять на здоровье ткани, по этой причине, мы используем канюлю с меньшим диаметром. При визуализации с целью погружения в воду 0,8 NA через канюли длиной 1,6 мм, внутреннего диаметра 2,5 мм было бы достаточно, чтобы сохранить полную NA. Тем не менее, 0,8 NA воды погружения целей имеют более короткий WD (3 мм в нашем случае), что может помешать фокусировки на SP.
Эти расчеты применяются к центру поля зрения в нижней части канюли. Тем не менее, перемещение поля изображения зрения боком – ближе к краям канюли – или фокусировки глубже в ткани – дальше от стеклянной поверхности канюли – еще больше уменьшает эффективное NA в фокусной плоскости и, таким образом, уменьшает разрешение. Это приведет к неоднородному разрешению различных объемов изображений ткани и может быть предметом озабоченности для количественной визуализации при субклеточном разрешении, особенно при использовании супер-разрешение методов, таких как 2P-STED микроскопии42. Эти вопросы менее важны при визуализации при сотовом разрешении.
Ткань движения.
Движение в ткани – происходящих от дыхания и сердцебиения у обезболенных животных – как правило, становятся более серьезными с увеличением расстояния от изображения канюли. Это возможно потому, что изображение канюли применяет механическое давление на мозг, таким образом, противодействуя некоторые движения в непосредственной близости от канюли (подобно неокортикальной подготовки). Таким образом, хотя визуализация дендритных шипов возможно в SR и SLM, в наших руках, это наиболее надежный спинной к SO до 200 мкм от поверхности канюли. Чтобы компенсировать движение, мы используем резонансные сканеры и усреднение в автономном режиме. Несколько изображений (от 4 до 6 повторений) приобретаются на плоскость изображения z-стека с максимальной доступной скоростью (30 кадров/с). Все повторения для каждого z-плана затем deconvolved (с использованием коммерческого программного обеспечения, АвтоКвант), зарегистрированы (с помощью ImageJ) и усреднены в одно изображение26. Для визуализации соматы, движение часто незначительно при анестезии35 и два средних часто достаточно, чтобы компенсировать движения артефактов.
Будущие приложения или направления метода .
Препарат можно комбинировать с микроэндоскопами26,43. Микро-эндоскопы являются жесткими оптическими зондами, которые используют градиентрея рефракционных индекса (GRIN) микролинзы для руководства светом и из глубокой ткани18. Использование микроэндоскопов позволяет канюли меньшего диаметра или даже не канюли на всех. Тем не менее, коммерческие микроэндоскопы менее хорошо корректируются для оптических аберраций и имеют более низкую NA, чем коммерческие цели. Текущие зонды достигают бокового и осевого разрешения 0,6-1 мкм, 10-12 мкм, соответственно17,18,44. Использование микроэндоскопов также позволяет сочетать этот препарат с головными встроенными широкоугольными микроскопами45,46,47.
Метод поддается также использовать в неанестезиированных мышей, и он был использован для исследования клеточной активности с помощью датчиков Ca2 “в проснулся головой фиксированной мышей21,37,48,49. В этих случаях, в связи с быстрыми временной шкалой изменений флуоресценции, рекомендуется внедрить линию регистрации50. Также можно адаптировать препарат для визуализации других гиппокампа субрегионов, таких как зубная извилина (DG)39,51,52. Сочетание этого препарата с 3P возбуждение53,54 с частотой 1 МГц импульсный лазер настроен до 1400 нм, мы смогли изображение глубже в гиппокампа формирования достижения молекулярного слоя, гранулы клеточного слоя и hilus ГД(рисунок 4) без удаления наложения CA1.
В заключение мы представляем метод, который обеспечивает оптический доступ к содварке гиппокампа и позволяет продольные и коррелятивные исследования динамики гиппокампа структуры и деятельности. Этот метод расширяет возможности анализа функции гиппокампа в физиологических и патологических условиях.
The authors have nothing to disclose.
U. A. F. поддерживается фондом Шрама; C.-W. T. P. и W. G. поддерживаются Обществом Макса Планка; L.Y. и R.Y. поддерживаются Обществом Макса Планка и Национальным институтом здравоохранения (R01MH080047, 1DP1NS096787); A. C. поддерживается грантом FP7 от Европейского исследовательского совета, программ ERANET и I-CORE, Главного научного управления Министерства здравоохранения Израиля, Федерального министерства образования и исследований, Роберто и Рената Рухман, Бруно и Симоне Лич, Нелла и Леон Бенозийо Центр неврологических заболеваний, Институт биомедицинской визуализации и геномики Генри Чаноха Крентера, Израильский научный фонд семьи Перлман, Аделис, Марк Бесен, Прэтт и Ирвинг И. Московиц; А. А. поддерживается Обществом Макса Планка, фондом Шрама и Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). 3P изображения были приобретены во время Расширенный курс по нейровизуализации Методы в Институте Макса Планка Флорида для неврологии. Расширенный курс по нейровизуализации Методы поддерживается Общество Макса Планка, штата Флорида Макс Планк Научной программы стипендий и Макс Планк Флорида Институт Корпорации Партнерства программы. Мы хотели бы поблагодарить Thorlabs, Coherent и SpectraPhysics за поддержку и оборудование для системы визуализации 2P / 3P в течение курса. Мы также благодарны Генри Хэберле и Мелиссе Эберле за помощь в системе в ходе курса.
Professional drill/grinder IBS/E | Proxxon GmbH | 28481 | Pecision drill |
MICROMOT drill stand MB 200 | Proxxon GmbH | 28600 | Movable ruler table |
MICRO compound table KT 70 | Proxxon GmbH | 27100 | Movable ruler table |
Machine vice MS 4 | Proxxon GmbH | 28132 | Movable ruler table |
Stainless steel tube Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mm | Sawade | R00303 | Stainless steel tube for the cannula metal ring |
Microscope Cover glass (4 mm round) | Engelbrecht Medizin and Labortechnik | Glass coverslips for the cannula glass | |
Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui | Hoffmann Group | 713750 160 | Manual files |
Präzisions-Nadelfeile Gesamtlänge 140 mm 4 | Hoffmann Group | 527230 4 | Manual files |
UV-Curing Optical Adhesives | Thorlabs | NOA81 | UV-curing adhesive |
UV Curing LED System, 365 nm | Thorlabs | CS2010 | UV-curing LED driver unit |
Stemi 305 | Zeiss | Stereoscope | |
Presto II | NSK-Nakanishi Germany | Z307015 | Dental drill |
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein | MF Dental | F837.014.FG | Files for the dental drill |
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob | MF Dental | G837.014.FG | Files for the dental drill |
Graefe Forceps – Straight / Serrated | Fine Science Tools | 11050-10 | Forceps for the surgery |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-05 | 0.5 mm width burr for the micro-drill |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-09 | 0.9 mm width burr for the micro-drill |
MicroMotor mit Handstück | DentaTec | MM11 | Micro-drill for the craniotomy |
Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Dumont forceps for the surgery |
Fine Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | Scissors for the surgery |
Trephine | MW Dental | 229-020 | Trephine drill – 3.0 mm diameter; for the micro-drill |
Stainless Steel Self-Tapping Bone Screws | Fine Science Tools | 19010-10 | 0.86 mm width bone screws |
Stereotaxic apparatus | Kopf | Stereotaxic apparatus | |
3-D-Gelenkarm | Hoffmann Group | 442114 | Stereotaxic arm and plate holder |
Aufnahme 2SM | Hoffmann Group | 442100 2SM | Stereotaxic arm and plate holder |
Hot Bead Sterilizers | Fine Science Tools | 18000-45 | Glass beads sterilizer |
Isofluran CP, Flasche 250 ml | Henry Schein VET GmbH | 798932 | Liquid isoflurane for anesthesia |
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Apparatus GmbH | 34-1040 | Isoflurane vaporizer |
Lab Active Scavenger | Gropper Medizintechnik | UV17014 | Isoflurane scavenger system |
Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml | Henry Schein VET GmbH | 798566 | Meloxicam, anti-inflammatory |
Vetalgin 500 mg/ml | MSD Tiergesundheit | Vetalgin, pain killer | |
CMA 450 Temperature Controller | Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus GmbH | 8003770 | Heating blanket |
Bepanthen Augen- und Nasensalbe | Bayer AG | Ophtalmic ointment | |
KL 1500 LCD | Schott | Fiber optic light source | |
Xylocain Pumpspray | AstraZeneca GmbH | Lidocain, local anesthetic | |
Absorption Triangles – Unmounted | Fine Science Tools | 18105-03 | Absorption triangles for the surgery |
Parkell C&B Metabond clear powder L | Hofmeester dental | 013622 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Quick Base B | Hofmeester dental | 013621 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Universal Catalyst C | Hofmeester dental | 013620 | Quick adhesive cement |
Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | Precision applicators for the surgery |
Blunt needles 0.9×23 mm | Dentina | 0441324 | Blunt needles |
Blunt needles 0.5×42 mm | Dentina | 0452155 | Blunt needles |
Blunt needles 0.3×23 mm | Dentina | 0553532 | Blunt needles |
Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | Acrylic liquid component |
Kallocryl | Speiko | 1609 | Acrylic powder |
Hydrofilm transparent roll | Hartmann | Adhesive film | |
Head plates | Custom made | 30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium | |
Head plate clamp | Custom made | Head plate holder | |
Pedestal post holders | Thorlabs | PH20E/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR30/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR75/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR150/M | Head plate holder |
Post connector clamps | Custom made | Head plate holder | |
Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps | Thorlabs | MB3045/M | Microscope stage |
7" x 4" Lab Jack | Thorlabs | L490/M | Microscope stage |
Low profile face mask small mice | Emka Technologies | VetFlo-0801 | Anesthesia facemask holder |
RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical Table | Newport | Floating table | |
S-2000A Top Performance Pneumatic Vibration Isolators with Automatic Re-Leveling | Newport | Floating table | |
Power Meter Model 1918-R | Newport | Power meter | |
X-Cite 120Q | Excelitas Technologies | Fluorescence lamp | |
Two-photon microscope | Bruker | Ultima IV | Two-photon microscopes |
Two-photon microscope | Thorlabs | Bergamo | Two-photon microscopes |
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5 | Olympus | Objectives | |
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18 | Olympus | Objectives | |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | Mai Tai Deep See | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | InSight DS+ Dual beam | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 3P excitation | Coherent | Monaco | Excitaiton lasers |