Выражение и очищение Nuclease-бесплатный кислород Scavenger Протокатечуат 3,4-Диоксигеназы
Summary
Протокатчуат 3,4-диоксигеназа (PCD) может ферментативно удалить свободный диатомический кислород из ваневой системы с помощью своего субстрата протокатчуйской кислоты (PCA). Этот протокол описывает экспрессию, очистку и анализ активности этого фермента очистки кислорода.
Abstract
Единая молекула (SM) микроскопия используется в изучении динамических молекулярных взаимодействий флюорофора помечены биомолекулы в режиме реального времени. Тем не менее, фторофоры склонны к потере сигнала через фотоотбеление растворенного кислорода (O2). Для предотвращения фотоотбеления и продления срока службы фторофора, системы очистки кислорода (OSS) используются для уменьшения O2. Коммерчески доступные ПСО могут быть загрязнены нуклеазами, которые повреждают или ухудшают нуклеиновой кислоты, сбивая с толку интерпретацию экспериментальных результатов. Здесь мы подробно протокол для выражения и очистки высокоактивных Pseudomonas putida протокатечуат-3,4-диоксигеназы (PCD) без каких-либо обнаруживаемых загрязнения нуклеазы. PCD может эффективно удалить реактивные O2 видов путем преобразования субстрата протокатчуйской кислоты (PCA) в 3-карбокси-цис, cis-muconic кислоты. Этот метод может быть использован в любой водной системе, где O2 играет пагубную роль в получении данных. Этот метод эффективен в производстве высокоактивных, нуклеаза бесплатно PCD по сравнению с коммерчески доступных PCD.
Introduction
Биофизика одной молекулы (SM) является быстро растущим полем, меняющим то, как мы смотрим на биологические явления. Эта область обладает уникальной способностью связывать фундаментальные законы физики и химии с биологией. Флуоресцентная микроскопия является одним из биофизических методов, которые могут достичь чувствительности СМ. Флуоресценция используется для обнаружения биомолекул, связывая их с небольшими органическими флюорофорами или квантовыми точками1. Эти молекулы могут излучать фотоны, когда возбужденных лазерами до фотоотбелевания необратимо2. Фотоотбеление происходит, когда флуоресцентные этикетки проходят химические повреждения, которые разрушают их способность возбуждать на желаемой длине волны2,3. Присутствие реактивных видов кислорода (ROS) в вавном буфере являются основной причиной фотоотбелевания2,4. Кроме того, ROS может повредить биомолекулы и привести к ошибочным наблюдениям в SM экспериментов5,6. Для предотвращения окислительного повреждения можно использовать системы очистки кислорода (OSS)3,7,8. Глюкоза оксидаза / каталазы (GODCAT) система эффективна при удалении кислорода8, но она производит потенциально опасных перекиси в качестве промежуточных. Они могут нанести ущерб биомолекулам, представляющим интерес в исследованиях СМ.
Кроме того, протокатчуат 3,4 диоксигеназы (PCD) будет эффективно удалить O2 из вогового раствора с помощью субстрата protocatechuic кислоты (PCA)7,9. PCD является металлоэнзим, который использует nonheme железа для координации PCA и катализировать катехиз омрачаемого кольца открытия реакции с помощью растворенного O210. Это один шаг реакции показано, что в целом лучше OSS для улучшения стабильности фторофора в SM экспериментов7. К сожалению, многие коммерчески доступные ферменты OSS, включая ПХД, содержат загрязняющие нуклеазы11. Эти загрязняющие вещества могут привести к повреждению субстратов на основе нуклеиновой кислоты, используемых в экспериментах с СМ. Эта работа позволит разъяснить протокол очистки на основе хроматографии для использования рекомбинантных PcD в системах SM. PCD может быть широко применен к любому эксперименту, где ROS повреждает субстраты, необходимые для получения данных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Системы очистки кислорода обычно включаются в одну молекулу флуоресценции микроскопии, чтобы уменьшить фотоотбеление3,7,8. Эти методы микроскопии часто используются для наблюдения нуклеиновых кислот или белковых взаимодействий с нук?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH GM121284 и AI126742 в KEY.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | βME |
| 30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Acetic acid, Glacial Certified ACS | Fisherl Chemical | A38C-212 | |
| Agar, Granulated | BD Biosciences | DF0145-17-0 | |
| AKTA FPLC System | GE Healthcare Life Sciences | AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | UFC201024 | 10 kDa MWCO |
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma | F-2262 | |
| Ammonium Persulfate (APS) Tablets | Amresco | K833-100TABS | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract | VWR | 90004-092 | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue | Amresco | 0472-50G | |
| Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate | Bio-Rad | 2240096EDU | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | PBS |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Granulated LB Broth Miller | EMD Biosciences | 1.10285.0500 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250-250G | |
| IPTG | Goldbio | I2481C25 | |
| Leupeptin | Roche | 11017128001 | |
| Lysozyme from Chicken Egg White | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Amresco | 0288-1KG | |
| Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability | Thermo Fisher | ND-2000C | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| Ni-NTA Superflow (100 ml) | Qiagen | 30430 | |
| Novagen BL21 Competent Cells | EMD Millipore | 69-449-3 | SOC media included |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Pepstatin | Gold Biotechnology | P-020-25 | |
| PMSF | Amresco | 0754-25G | |
| Protocatechuic acid | Fisher Scientific | ICN15642110 | PCA |
| Sodium dodecyl sulfate | P212121 | CI-00270-1KG | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devises | ||
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-04 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-02 | |
| Superose 12 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517301 | |
| TEMED | Amresco | 0761-25ML | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager | GE Healthcare Life Sciences | ||
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 |
Referências
- Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).
- Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
- Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).
- Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).
- Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
- Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
- Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
- Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
- Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).
