Isolamento delle cellule Miepiteliali da adulti murina lacrimale e ghiandole sottomandibolari
Summary
La ghiandola lacrimale (LG) ha due tipi di cellule che esprimono α-liscio muscolo actina (αSMA): cellule miepiteliali (MECs) e pericytes. I MECs sono di origine ectodermica, trovati in molti tessuti ghiandolari, mentre i periciti sono cellule muscolari lisce vascolari di origine endodermica. Questo protocollo isola i MECs e i periciti di murine LGs.
Abstract
La ghiandola lacrimale (LG) è una ghiandola tubuloacinar esocrina che secra uno strato acquoso di pellicola lacrimale. L’albero epiteliale LG è costituito da acinar, epiteliale duttale, e cellule miepiteliali (MECs). MECs Express Alpha liscio muscolo actina (αSMA) e hanno una funzione contrattile. Si trovano in più organi ghiandolari e sono di origine ectodermica. Inoltre, l’LG contiene cellule muscolari lisce vascolari SMA + di origine endodermica chiamate pericytes: cellule contrattili che avvolgono la superficie dei tubi vascolari. Un nuovo protocollo ci permette di isolare sia i MECs che i periciti dal LGs e dalle ghiandole sottomandibolari adulti (SMG). Il protocollo si basa sull’etichettatura genetica dei MECs e dei periciti utilizzando il ceppo del mouse SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/FL , seguito dalla preparazione della sospensione a singola cellula LG per la selezione delle cellule attivate a fluorescenza (FACS ). Il protocollo consente la separazione di queste due popolazioni di cellule di diversa origine in base all’espressione della molecola di adesione delle cellule epiteliali (EpCAM) da parte di MECs, mentre i periciti non esprimono EpCAM. Le cellule isolate potrebbero essere utilizzate per la coltivazione di cellule o l’analisi dell’espressione genica.
Introduction
Le cellule mioepiteliali (MECs) sono presenti in molte ghiandole esocrine tra cui lacrimali, salivari, harderian, sudore, prostata, e mammaria. I MECs sono un tipo di cellula unico che combina un epiteliale e un fenotipo muscolare liscio. MECS Express α-liscio muscolo actina (SMA) e hanno una funzione contrattile1,2. Oltre ai MECs, la ghiandola lacrimale (LG) e la ghiandola sottomandibolare (SMG) contiene cellule vascolari SMA + chiamate pericytes, che sono cellule di origine endodermica che avvolgono la superficie dei tubi vascolari3. Sebbene MECS e periciti esprimano molti marcatori, SMA è l’unico marcatore che non è espresso in altre celle LG e SMG1,3.
Negli ultimi 40 anni, diversi laboratori hanno riferito saggi per la dissociazione di diversi tessuti della ghiandola esocrina, in cui sono stati applicati approcci non enzimatici ed enzimatici. In una delle prime relazioni pubblicate nel 1980, Fritz e i coautori hanno descritto un protocollo per isolare i parotidi felini utilizzando la digestione sequenziale in una soluzione4di collagenasi/tripsina. In 1989, Hann e coautori hanno regolato questo protocollo per l’isolamento di acini dal ratto LGs usando una miscela di collagenasi, ialuronidasi e DNase5. In 1990, Cripps e colleghi hanno pubblicato il metodo di dissociazione non enzimatica della ghiandola lacrimale acini6. In seguito, nel 1998, Zoukhri e coautori tornarono a un protocollo di dissociazione enzimatica per seguire l’imaging di CA2 +su LG e SMG isolato acini7. Nell’ultimo decennio, i ricercatori hanno rivolto la loro attenzione all’isolamento delle cellule staminali/progenitrici dalle ghiandole esocrine. Pringle e coautori hanno descritto un protocollo in 2011 per l’isolamento delle cellule staminali del topo SMG8. Questo metodo era basato sull’isolamento di salisfere contenenti cellule staminali, che sono state mantenute nella cultura. Gli autori hanno affermato che le cellule proliferanti che esprimono marcatori associati alle cellule staminali potrebbero essere isolate da questi salisfere8. Shatos e coautori hanno pubblicato il protocollo per l’isolamento delle cellule progenitrici da un LGs ratto adulto non infortunato usando la digestione enzimatica e raccogliendo le cellule “liberate”9. In seguito, nel 2015, Ackermann e i coautori regolarono questa procedura per isolare le presettive “cellule staminali della ghiandola lacriale murina” (“mLGSCs”) che potevano essere propagate come coltura mono-strato su più passaggi10. Tuttavia, nessuna delle procedure prima menzionate consentiva di distinguere sottotipi cellulari e singole popolazioni di cellule epiteliali isolate. Nel 2016, Gromova e coautori hanno pubblicato una procedura per l’isolamento delle cellule staminali/progenitrici LG da adulti murine LGs utilizzando FACS11. Tuttavia, questo protocollo non intendeva isolare i MECs.
Recentemente, abbiamo dimostrato che siamo in grado di isolare le celle SMA + da 3 topi SMA-GFP12settimane. Tuttavia, in questo momento non abbiamo separato diverse popolazioni di cellule SMA +. Qui abbiamo istituito una nuova procedura per l’isolamento diretto di MECS differenziati e periciti da Lgs adulto e SMG.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo manoscritto descrisse un protocollo di MEC e di isolamento pericyte da LG e SMG. Questa procedura è stata basata sull’etichettatura genetica di SMA, l’unico biomarcatore affidabile di MECs e pericytes.
L’urgenza di sviluppare questo protocollo è stata motivata dalla quasi totale assenza di letteratura che evidenzia l’isolamento dei MECs da parte del LGs e dell’SMG murino. Anche se l’etichettatura genetica è stata utilizzata in precedenza, utilizzando i topi SMA-GFP per isolare le cel…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il dottor Ivo kalajzic per averci fornito il ceppo di mouse SMACreErt2 , Takeshi umazume per la coda del mouse e la genotipizzazione, Mark Shelley per l’acquisizione di immagini professionali per la figura 2. Ringraziamo anche Scripps Consiglio degli editori scientifici e Mark Shelley per l’editing scientifico inglese. Siamo grati al nucleo di citometria a flusso di Scripps Research Institute per l’assistenza con la cernita delle cellule e per il Dr. Robin Willenbring per più discussioni/consigli sull’analisi dei dati FACS.
Questo lavoro è stato sostenuto dagli istituti nazionali di salute, National Eye Institute Grants 5 R01 EY026202 e 1 R01 EY028983 a H.P.M.
Materials
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 ml Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1000mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
Referências
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