فحص الهجرة الصفر وغرفة الجلد السمرة لتحليل في المختبر وفي الجسم الحي للشفاء الجروح
Summary
هنا، نقدم بروتوكول احتساء الصفر في المختبر باستخدام الخلايا الليفية الأولية ولإجراء اختبار التئام الجروح في الجلد في الجسم الحي في الفئران. كلا الاختبارين هما طريقتان مباشرتان لتقييم الجروح في المختبر وفي الجسم الحي.
Abstract
يعد ضعف التئام الجروح الجلدية مصدر قلق كبير للمرضى الذين يعانون من مرض السكري والمسنين، وهناك حاجة إلى علاج فعال. الملائمة في المختبر وفي الجسم الحي هي ضرورية لتحديد جزيئات الهدف الجديد لعلاج المخدرات لتحسين عملية التئام الجروح الجلدية. حددنا الوحدة الفرعية β3 من قنوات الكالسيوم المسورة بالجهد (Cavβ3) كجزيء هدف محتمل للتأثير على التئام الجروح في اختبارين مستقلين، أي فحص الهجرة الصفر في المختبر ونموذج غرفة الجلد في الجسم الحي الظهري. الخلايا الليفية الجنينية الأولية (MEFs) معزولة بشكل حاد عن الفئران البرية من النوع (WT) وCavβ3 نقص الفئران (Cavβ3 KO) أو الخلايا الليفية المعزولة بشكل حاد من الفئران WT المعالجة مع siRNA إلى أسفل تنظيم التعبير عن الجين Cacnb3 ، ترميز Cavβ3، تم استخدامها. تم تطبيق خدش على خلية أحادية اللون confluent وأعقب إغلاق الفجوة من قبل التقاط الصور المجهرية في نقاط زمنية محددة حتى إعادة السكان كاملة من الفجوة من قبل الخلايا المهاجرة. تم تحليل هذه الصور، وتم تحديد معدل ترحيل الخلايا لكل حالة. في فحص في الجسم الحي، زرعنا غرفة الجلد الظهرية على الفئران WT وCavβ3 KO، وتطبيق جرح دائري محدد من قطر 2 ملم، وغطت الجرح مع غطاء زجاجي لحمايته من العدوى والجفاف، ورصد إغلاق الجرح العيانية مع مرور الوقت. وكان إغلاق الجرح أسرع بكثير في Cacnb3-الفئران نقص الجينات. لأن نتائج الاختبارات في الجسم الحي والمختبر ترتبط بشكل جيد، قد يكون الفحص في المختبر مفيدة للفحص عالي الإنتاجية قبل التحقق من صحة الضربات في المختبر من قبل نموذج التئام الجروح في الجسم الحي. ما أظهرناه هنا للفئران أو الخلايا التي تعاني من نقص في البراري وCavβ3 قد ينطبق أيضًا على جزيئات محددة غير Cavβ3.
Introduction
يبدأ التئام الجروح الجلدية مباشرة بعد إصابة الجلد من أجل استعادة سلامة الجلد وحماية الكائن الحي من العدوى. عملية التئام الجروح تمر بأربع مراحل متداخلة. التخثر، التهاب، تشكيل الأنسجة الجديدة، وإعادة عرض الأنسجة1. وهجرة الخلايا أمر بالغ الأهمية خلال هذه المراحل. يتم تنشيط الخلايا الالتهابية والخلايا المناعية والخلايا الكيراتينية والخلايا البطانية والخلايا الليفية في نقاط زمنية مختلفة وغزو منطقة الجرح2. طرق التحقيق في التئام الجروح في المختبر وفي الجسم الحي هي ذات أهمية كبيرة ليس فقط لفهم الآليات الكامنة ولكن أيضا لاختبار أدوية جديدة ووضع استراتيجيات جديدة تهدف إلى تحسين وتسريع التئام الجروح الجلد.
لمراقبة وتحليل ترحيل الخلايا، يمكن استخدام فحص ترحيل الخدش. وغالبا ما يشار إليها باسم في المختبر التئام الجروح الاختبار. يتطلب هذا الأسلوب مرفق ثقافة الخلية3. وهو إجراء بسيط، ليست هناك حاجة للمعدات الراقية ويمكن إجراء الفحص في معظم مختبرات بيولوجيا الخلايا. في هذا الفحص، يتم إنشاء منطقة خالية من الخلايا عن طريق التعطيل الميكانيكي لخلية أحادية اللمعة، ويفضل أن تكون خلايا أو ليفية تشبه الظهارية أو البطانية. سيتم ترحيل الخلايا الموجودة على حافة الخدش من أجل إعادة ملء الفجوة التي تم إنشاؤها. والقياس الكمي للمنطقة الخالية من الخلايا المتناقصة مع مرور الوقت يشبه معدل الهجرة ويشير إلى الوقت الذي تحتاج إليه الخلايا لسد الفجوة. لهذا الغرض، يمكن للمحققين استخدام إما خلايا معزولة بشكل حاد من الفئران WT أو الفئران تفتقر إلى جين من الفائدة4، أو الخلايا الخالدة المتاحة من مستودعات الخلايا موثوق بها. يسمح تحليل الصفر بدراسة تأثير المركبات النشطة الدوائية أو تأثير cDNAs أو siRNAs على هجرة الخلايا.
في الجسم الحي، التئام الجروح هو عملية فسيولوجية معقدة، تتطلب أنواع مختلفة من الخلايا بما في ذلك الخلايا الكيراتينية، الخلايا الالتهابية، الخلايا الليفية، الخلايا المناعية والخلايا البطانية من أجل استعادة السلامة البدنية للبشرة في أسرع وقت ممكن1 . وقد وضعت طرق مختلفة للدراسة في التئام الجروح في الجسم الحي واستخدامها في الماضي5و6و7و8. غرفة الجلد الظهرية الموصوفة في هذه المقالة كانت تستخدم سابقا لالتئام الجروح الاختبارات9. يتم استخدامه كإعداد غرفة الجلد الظهرية المعدلة للفئران. نموذج غرفة skinfold المعدلة لديها العديد من المزايا. 1) أنه يقلل من تقلص الجلد، مما يمنع مراقبة عملية التئام الجروح، ويمكن أن تؤثر على إصلاح الجروح في الفئران. 2) هذه الغرفة يجعل من استخدام تغطية الجرح مع غطاء زجاجي، والحد من التهابات الأنسجة والجفاف، والتي يمكن أن تؤخر عملية الشفاء. 3) يمكن رصد تدفق الدم والأوعية الدموية مباشرة. 4) فإنه يسمح التطبيق الموضعي المتكرر للمركبات النشطة الدوائية والكواشف من أجل علاج الجرح وتسريع الشفاء9،10.
حددنا الوحدة الفرعية β3 من قنوات الكالسيوم عالية الجهد المسورة (Cavβ3) كجزيء الهدف المحتمل للتأثير على التئام الجروح الجلد باستخدام بروتوكولين مستقلين، أي، في المختبر فحص الهجرة الصفر ونموذج غرفة الجلد في الجسم الحي الظهري. للاختبار في المختبر، استخدمنا الخلايا الليفية الأولية، وهذه الخلايا لا تعبر عن الجين Cacnb3 ترميز البروتين Cavβ3 ولكن تفتقر إلى إلغاء الاستقطاب الناجمعن Ca2+ تدفق أو التيارات Ca2 + تعتمد على الجهد. وصفنا وظيفة جديدة من Cavβ3 في هذه الخلايا الليفية: Cavβ3 يربط إلى مستقبلات الإينوزيتول 1,4,5-تريسفوسفات (IP3R) والقيود الإفراج عن الكالسيوم من الشبكية endoplasmic. حذف الجين Cacnb3 في الفئران يؤدي إلى زيادة حساسية IP3R لIP3، وتعزيز هجرة الخلايا وزيادة إصلاح الجرح الجلد4.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المخطوطة، نصف دراسة في المختبر وفي الجسم الحي للشفاء من الجروح وربط النتائج التي تم الحصول عليها. للفحص في المختبر، استخدمنا الخلايا الليفية الماوس الأولية4،14،15 التي تلعب دورا هاما في التئام الجروح وإعادة عرض الأنسجة11.</s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتورة بيترا فايسجربر ووحدة ترانسجين التابعة للمنشأة الحيوانية لمنتدى جنوب المحيط الهادئ (المشروع P2 من SFB 894) التابعة لكلية الطب والمنشأة الحيوانية في معهد الجراحة السريرية والتجريبية في كلية الطب في جامعة سارلاند، هومبورغ. نشكر الدكتور أندرياس بيك على قراءته النقدية للمخطوطة. تم تمويل هذه الدراسة من قبل وزارة المالية الألمانية Sonderforschungsbereich (SFB) 894، المشروع A3 إلى A.B. و V.F.).
Materials
| 0.9 % NaCl | |||
| 1 ml syringes | BD Plastipak | 303172 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Biopsy punch | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
| Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
| Depilation cream | any depilation cream | ||
| Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 41966-029 | |
| Fetal bovine serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | |
| Hexagon full nut | |||
| Ketamine hydrochloride | Zoetis | KETASET | |
| Light microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-8000 | Similar microscopes might be used |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| Micro-forceps | |||
| Micro-Scissors | |||
| Mouse restrainer | Home-made | ||
| Normal scissors | |||
| Objective | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
| Polypropylene sutures | |||
| Screwdriver | |||
| Skin disinfectant (octeniderm) | Schülke & Mayr GmbH | 118212 | |
| Slotted cheese head screw | |||
| Snap ring | |||
| Snap ring plier | |||
| Surgical microscope with camera | Leica | Leica M651 | |
| Titanium frames for the skinfold chamber | IROLA | 160001 | Halteblech M |
| Wire piler |
Referências
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Martin, P. Wound healing–aiming for perfect skin regeneration. Science. 276, 75-81 (1997).
- Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro. Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).
- Belkacemi, A., et al. IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3. Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).
- Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment. Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).
- Vagesjo, E., et al. Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria. Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).
- Eming, S. A., et al. Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10. American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).
- Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels. Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Chen, L., et al. Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway. Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).
- Dewor, M., et al. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro. FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).
- Handly, L. N., Wollman, R. Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism. Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).
- Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration. Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).
- Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics. PLoS One. 11, 0167583 (2016).
- Reinhart-King, C. A. Endothelial cell adhesion and migration. Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).
- Treloar, K. K., Simpson, M. J. Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays. PLoS One. 8, 67389 (2013).
- Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. Serum starvation: caveat emptor. American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).
- Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold. Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).
- Deoliveira, D., et al. An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing. International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).
- Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: Contraction revisited. Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. Journal of Visualized Experiment. (75), e50265 (2013).
- Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway. Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).
