划痕迁移分析和背皮折叠室的体外和在Vivo分析伤口愈合
Summary
在这里，我们提出了使用原纤维细胞进行体外划痕测定和小鼠体内皮肤伤口愈合测定的协议。这两种检测都是评估体外和体内伤口愈合的直截了当的方法。
Abstract
受损的皮伤愈合是糖尿病患者和老年人的主要关切，需要有效的治疗。适当的体外和体内方法对于确定新的靶分子以进行药物治疗以改善皮肤伤口愈合过程至关重要。我们确定电压门控钙通道（Cav_3）的β3亚单位是影响伤口愈合的潜在靶分子，在两个独立的测定中，即体外划痕迁移测定和体内背膜皮肤折叠室模型。从野生型 （WT） 和 Cav+3 缺陷小鼠 （Cav+3 KO） 急性分离的原源小鼠胚胎成纤维细胞 （MEF） 或从使用 siRNA 治疗的 WT 小鼠急性分离成纤维细胞，以降低Cacnb3基因的表达，使用编码 Cav=3。对汇体细胞单层进行了划痕，然后通过在规定的时间点拍摄微量图像，直到迁移细胞完全重新填充间隙。对这些图像进行了分析，并为每个情况确定了细胞迁移率。在体内测定中，我们在WT和Cav_3 KO小鼠上植入了背皮折叠室，应用了直径为2毫米的圆形伤口，用玻璃盖玻片覆盖伤口，以保护伤口免受感染和干燥，并监测宏观伤口闭合随着时间的推移。在Cacnb3-基因缺乏小鼠中，伤口闭合速度明显加快。由于体内和体外测定的结果关联性良好，因此，在验证体外伤口愈合模型对体外命中之前，体外测定法可能对高通量筛选有用。我们在这里展示的野生型和Cav=3缺陷小鼠或细胞可能也适用于Cav_3以外的特定分子。
Introduction
皮肤伤口愈合在皮肤损伤后立即开始，以恢复皮肤的完整性，并保护生物体免受感染。伤口愈合过程经历四个重叠阶段;凝固，炎症，新的组织形成，和组织重塑1。在这些阶段，细胞迁移至关重要。炎症细胞、免疫细胞、角蛋白细胞、内皮细胞和成纤维细胞在不同的时间点被激活并侵入伤口区域2。研究体外和体内伤口愈合的方法不仅对了解其基本机制非常感兴趣，而且对测试新药和开发旨在改善和加速皮肤伤口愈合的新策略都具有重大意义。
要监视和分析单元格迁移，可以使用临时迁移分析。它通常被称为体外伤口愈合测定。此方法需要细胞培养工具3。这是一个简单的程序，不需要高端设备，大多数细胞生物学实验室都可以进行检测。在此测定中，通过汇体细胞单层的机械破坏（优选上皮或内皮状细胞或成纤维细胞）的机械破坏而创建无细胞区域。划痕边缘的单元格将迁移以重新填充创建的间隙。随时间减少的无细胞区域的量化类似于迁移速率，并指示细胞需要缩小间隙的时间。为此，研究人员可以使用WT小鼠的急性分离细胞或缺乏4基因的小鼠，或从可靠的细胞储存库获得的永生细胞。划痕测定允许研究药理活性化合物的影响或转染的cDNA或siRNA对细胞迁移的影响。
在体内，伤口愈合是一个复杂的生理过程，需要不同的细胞类型，包括角蛋白细胞、炎症细胞、成纤维细胞、免疫细胞和内皮细胞，以便尽快恢复皮肤的物理完整性1.在过去的5、6、7、8，研究体内伤口愈合的不同方法已经开发并使用了。本文中描述的背皮折叠室以前用于伤口愈合测定9。它用作小鼠的改性背皮折叠室制剂。改性皮肤折叠室模型具有几个优点。1） 它最大限度地减少皮肤收缩，这阻止观察伤口愈合过程，并可能影响小鼠的伤口修复。2） 本室使用玻璃盖玻片覆盖伤口，减少组织感染和干燥，这可能延迟愈合过程。3） 血流量和血管化可以直接监测。4）它允许重复局部应用药理活性化合物和试剂，以治疗伤口和加速愈合9，10。
我们使用两种独立的方案，即体外划痕迁移测定和体内背皮折叠室模型，将高压门控钙通道（Cav_3）的β3亚单位确定为影响皮肤伤口愈合的潜在靶分子。对于体外测定，我们使用原发性成纤维细胞，这些细胞确实表达了编码Cav_3蛋白的Cacnb3基因，但缺乏去极化引起的Ca2+流入或电压依赖的Ca2+电流。我们描述了Cav_3在这些成纤维细胞中的新功能：Cav_3与肌醇1，4，5-三磷酸盐受体（IP3R）结合，并约束内质神经质的钙释放。在小鼠中删除Cacnb3基因可提高IP3R对IP3的敏感性，增强细胞迁移和增加皮肤伤口修复4。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这份手稿中，我们描述了体外和体内伤口愈合测定，并关联了获得的结果。对于体外测定，我们使用原位小鼠成纤维细胞4，14，15，在伤口愈合和组织重塑11中发挥重要作用。其他作为单层生长的粘附细胞类型（例如，上皮细胞、内皮细胞、角蛋白细胞）也可用于。电镀相同数量的活细胞和健康细胞，并在?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢佩特拉·韦斯伯格博士和卫生院SPF动物设施的转基因单位（SFB 894项目P2）和洪堡萨尔兰大学医学院临床和实验外科研究所的动物设施。我们感谢安德里亚斯·贝克博士对手稿的批判性阅读。这项研究由德国金融管理局（DFG）Sonderforssssbereich（SFB）894资助，A3项目对A.B.和V.F.）。
Materials
| 0.9 % NaCl | |||
| 1 ml syringes | BD Plastipak | 303172 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Biopsy punch | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
| Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
| Depilation cream | any depilation cream | ||
| Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 41966-029 | |
| Fetal bovine serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | |
| Hexagon full nut | |||
| Ketamine hydrochloride | Zoetis | KETASET | |
| Light microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-8000 | Similar microscopes might be used |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| Micro-forceps | |||
| Micro-Scissors | |||
| Mouse restrainer | Home-made | ||
| Normal scissors | |||
| Objective | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
| Polypropylene sutures | |||
| Screwdriver | |||
| Skin disinfectant (octeniderm) | Schülke & Mayr GmbH | 118212 | |
| Slotted cheese head screw | |||
| Snap ring | |||
| Snap ring plier | |||
| Surgical microscope with camera | Leica | Leica M651 | |
| Titanium frames for the skinfold chamber | IROLA | 160001 | Halteblech M |
| Wire piler |
Referências
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