스크래치 마이그레이션 분석 및 등갈 피부 접기 챔버 에서 생체 외 및 상처 치유의 생체 내 분석
Summary
여기서, 우리는 1차 섬유아세포를 이용한 시험관내 스크래치 분석및 마우스에서 의 피부 상처 치유 분석실험을 위한 프로토콜을 제시한다. 두 방법 모두 시험관 내 및 생체 내 상처 치유를 평가하는 간단한 방법입니다.
Abstract
손상된 절단 상처 치유는 당뇨병을 앓고있는 환자와 노인에게 중요한 관심사이며 효과적인 치료가 필요합니다. 적절한 생체외 및 생체내 접근법은 피부 상처 치유 과정을 개선하기 위한 약물 치료를 위한 새로운 표적 분자의 식별에 필수적이다. 우리는 전압 게이트 칼슘 채널 (Cavβ3)의 β3 소단위를 두 개의 독립적 인 분석법, 즉 생체 외 스크래치 이동 분석 및 생체 내 등쪽 피부 접힘 챔버 모델에서 상처 치유에 영향을 미치는 잠재적 인 표적 분자로 확인했습니다. 1 차 마우스 배아 섬유아세포 (MEFs) 야생 형 (WT) 및 Cavβ3 결핍 마우스 (Cavβ3 KO) 또는 SiRNA로 처리 된 WT 마우스로부터 급성으로 분리 된 섬유 아세포는 Cacnb3 유전자의 발현을 하향 조절합니다. , Cavβ3을 인코딩하여 사용했습니다. 스크래치는 결합 된 세포 단층에 적용하고 갭 클로저는 마이그레이션 셀에 의해 갭의 완전한 재모독까지 정의 된 시점에서 현미경 이미지를 복용하여 뒤따랐다. 이들 이미지는 분석되었고, 각 조건에 대해 세포 이동 속도를 결정하였습니다. 생체 내 분석에서, 우리는 WT와 Cavβ3 KO 마우스에 등쪽 피부 접이식 챔버를 이식하고, 직경 2mm의 정의된 원형 상처를 적용하고, 감염및 탈수로부터 보호하기 위해 유리 커버 슬립으로 상처를 덮고, 거시적 상처 폐쇄를 모니터링했습니다. 시간이 지남에 따라. 상처 폐쇄는 Cacnb3-유전자결핍 마우스에서 상당히 빨랐다. 생체외 분석의 결과는 생체외 분석과 상관관계가 잘 연관되기 때문에, 시험관내 분석노는 생체내 상처 치유 모델에 의한 시험관 내 안타를 검증하기 전에 높은 처리량 스크리닝에 유용할 수 있다. 우리가 야생형 및 Cavβ3 결핍 마우스 또는 세포를 위해 여기에서 보여준 것은 또한 Cavβ3 이외에 특정 분자를 위해 적용될 수 있습니다.
Introduction
피부 상처 치유는 피부의 무결성을 회복하고 감염으로부터 유기체를 보호하기 위해 피부 손상 직후에 시작됩니다. 상처 치유 과정은 네 개의 겹치는 단계를 거칩니다. 응고, 염증, 새로운 조직 형성 및 조직 리모델링1. 세포 마이그레이션은 이러한 단계에서 매우 중요합니다. 염증성 세포, 면역 세포, 각질 세포, 내피 세포 및 섬유아세포는 상이한 시점에서 활성화되고 상처 부위2를침범한다. 시험관 내 및 생체 내 상처 치유를 조사하는 방법은 근본적인 메커니즘을 이해하는 것뿐만 아니라 새로운 약물을 테스트하고 피부 상처 치유를 개량하고 가속화하는 것을 목표로하는 새로운 전략을 개발하는 데 큰 관심이 있습니다.
셀 마이그레이션을 모니터링하고 분석하기 위해 스크래치 마이그레이션 분석을 사용할 수 있습니다. 그것은 종종 시험관 내 상처 치유 분석이라고합니다. 이 방법은 세포 배양 시설3을필요로 한다. 그것은 간단한 절차이고, 고급 장비의 필요가 없고 대부분의 세포 생물학 실험실에서 분석이 수행될 수 있습니다. 이 분석에서, 무세포 영역은 동봉된 세포 단층, 바람직하게는 상피-또는 내피 유사 세포 또는 섬유아세포의 기계적 파괴에 의해 생성된다. 스크래치 가장자리의 셀은 생성된 간격을 다시 채우기 위해 마이그레이션됩니다. 시간이 지남에 따라 감소하는 세포 없는 영역의 정량화는 이동 속도와 유사하며 세포가 간격을 좁힐 필요가 있는 시간을 나타냅니다. 이를 위해, 조사자는 WT 마우스 또는 관심 유전자가 결여된 마우스로부터의 급성 단리된 세포또는4, 또는 신뢰할 수 있는 세포 저장소로부터 사용할 수 있는 불멸의 세포를 사용할 수 있다. 스크래치 분석법은 약리활성 화합물의 영향 또는 형질 감염된 cDNAs 또는 siRNAs가 세포 이동에 미치는 영향을 연구할 수 있게 합니다.
생체 내에서 상처 치유는 피부의 물리적 무결성을 가능한 한 빨리 복원하기 위해 각질 세포, 염증 세포, 섬유 아세포, 면역 세포 및 내피 세포를 포함한 다양한 세포 유형을 필요로하는 복잡한 생리적과정입니다 1 . 생체 내에서 연구하는 다른 방법은 과거5,6,7,8에서개발및 사용되어 왔다. 본 항에 기재된 등쪽 피부접이식 챔버는 이전에 상처 치유 어세9에사용되었다. 마우스에 대한 변형된 등지 피부 접힘 챔버 제제로서 사용된다. 변형된 스킨폴드 챔버 모델은 몇 가지 장점이 있다. 1) 그것은 상처 치유 과정을 관찰하는 것을 방지하고 마우스의 상처 수리에 영향을 미칠 수있는 피부 수축을 최소화합니다. 2) 이 챔버는 유리 커버 슬립으로 상처를 덮어 조직 감염과 탈수를 줄여 치유 과정을 지연시킬 수 있습니다. 3) 혈류와 혈관을 직접 모니터링 할 수 있습니다. 4) 상처를 치료하고 치유를 가속화하기 위해 약리활성 화합물 및 시약의 반복적 인 국소 적용을허용9,10.
우리는 고전압 게이트 칼슘 채널 (Cavβ3)의 β3 소단위를 두 개의 독립적 인 프로토콜, 즉 생체 외 스크래치 이동 분석 및 생체 내 등쪽 피부 접힘 챔버 모델을 사용하여 피부 상처 치유에 영향을 미치는 잠재적 인 표적 분자로 확인했습니다. 시험관내 분석의 경우, 우리는 1차 섬유아세포를 사용하였지만, 이들 세포는 Cavβ3 단백질을 코딩하는 Cacnb3 유전자를 발현하지만 탈분극 유도된Ca2+ 유입 또는 전압 의존적Ca2+ 전류가 부족하다. 우리는 이 섬유아세포에서 Cavβ3의 새로운 기능을 기술했습니다: Cavβ3는 이노시톨 1,4,5-삼위산염 수용체(IP3R)에 결합하고 소포체로부터 칼슘 방출을 제약합니다. 마우스에서 Cacnb3 유전자의 삭제는 IP3에 대한 IP3R의 감도 증가, 향상된 세포 이동 및 증가된 피부 상처 복구4를유도한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고에서, 우리는 생체 외 및 생체 내 상처 치유 분석기를 설명하고 얻어진 결과를 상관시상한다. 시험관내 분석의 경우, 1차 마우스 섬유아세포4,14,15를 사용하였으며 이는 상처 치유 및 조직 리모델링에 중요한 역할을 한다11. 단층으로 성장하는 다른 부착 세포 유형 (예를 들어, 상피 세포, 내피 세포, 각?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 박사 페트라 바이스 거버와 SPF 동물 시설의 트랜스 유전자 단위 (SFB의 프로젝트 P2 894) 의료 학부의 및 자를 란트 대학의 의료 학부에서 임상 및 실험 수술 연구소의 동물 시설, 홈버그. 안드레아스 벡 박사님이 원고를 비판적으로 읽어 주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 도이치 포르충스게마인샤프트(DFG) 손더포스충스베라이히(SFB) 894, A3~A.B. 및 V.F.에 의해 지원되었다.
Materials
| 0.9 % NaCl | |||
| 1 ml syringes | BD Plastipak | 303172 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Biopsy punch | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
| Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
| Depilation cream | any depilation cream | ||
| Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 41966-029 | |
| Fetal bovine serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | |
| Hexagon full nut | |||
| Ketamine hydrochloride | Zoetis | KETASET | |
| Light microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-8000 | Similar microscopes might be used |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| Micro-forceps | |||
| Micro-Scissors | |||
| Mouse restrainer | Home-made | ||
| Normal scissors | |||
| Objective | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
| Polypropylene sutures | |||
| Screwdriver | |||
| Skin disinfectant (octeniderm) | Schülke & Mayr GmbH | 118212 | |
| Slotted cheese head screw | |||
| Snap ring | |||
| Snap ring plier | |||
| Surgical microscope with camera | Leica | Leica M651 | |
| Titanium frames for the skinfold chamber | IROLA | 160001 | Halteblech M |
| Wire piler |
Referências
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