Функционализация атомной силы Микроскоп Кантилеверс с одно-T-клеток или одночастицы для иммунологической одноклеточной силы спектроскопии
Summary
Мы представляем протокол для функционализации атомной силы микроскопа (AFM) кантилеверс с одной Т-клетки и частицы биса для иммунологических исследований. Показаны процедуры зондирования однопартной Т-дендритной связывания клеток AFM и мониторинга клеточной реакции макрофагов в реальном времени на одну твердую частицу с помощью флуоресценции.
Abstract
Атомная силовая микроскопия на основе одноклеточной силовой спектроскопии (AFM-SCFS) является мощным инструментом для изучения биофизических свойств живых клеток. Этот метод позволяет зондировать прочности взаимодействия и динамики на мембране клетки в реальном маштабе времени, включая те между клетками, приемными устройствами и ligands, и наряду со многими другими изменениями. Он также работает как механизм для доставки физического или биохимического стимула на одиночных клетках в пространственно контролируемой манере, что позволяет конкретной активации клеток и последующих клеточных событий, которые будут контролироваться в режиме реального времени в сочетании с живой клеткой флуоресценция. Ключевым шагом в этих измерениях AFM-SCFS является функционализация AFM-cantilever, или, другими словами, присоединение предмета, интересующего к кантилевер. Здесь мы представляем методы модификации AFM кантилеверов с одной Т-клеток и одной бустирой полистирола соответственно для иммунологических исследований. Первый включает в себя биосовместимый клей, который пары одного Т-клеток на кончике плоского кантилевера в растворе, в то время как последний опирается на эпоксидный клей для одной саженки биса в воздушной среде. Предусмотрены также два иммунологических применения, связанных с каждой модификацией кантилевера. Описанные здесь методы могут быть легко адаптированы к различным типам клеток и твердым частицам.
Introduction
Атомная микроскопия силы (AFM), универсальный инструмент, нашелмного применений в исследованиях клеточной биологии 1,2,3,4. Помимо своей высокой возможности изображения разрешения, родная функция зондирования силы позволяет биофизические свойства живых клеток, которые будут исследованы непосредственно на месте на одноклеточном уровне6,7. К ним относятся жесткости субклеточныхструктур или даже целые клетки 8,9,10,11,12, конкретные лиганд / рецептор связывания сильные силы на одномолекулярный уровень на поверхности клетки13,и силы стыковки междуоднопартными парами твердых частиц и клеток или между двумя клетками 1,2,14,15. Последние два часто классифицируются как одноклеточная спектроскопия силы (SCFS)16. Благодаря легкодоступным кантилеверам с различными весенними константами диапазон сил, доступный для AFM, довольно широк от нескольких пиконевтонов (pN) до микроньютонов (кН), который адекватно покрывает весь спектр клеточных событий, включающих силы из нескольких десятков pN, таких как рецептор на основе одномолекулярных связывания, на nN, таких как фагоцитные клеточные события15. Этот большой динамический диапазон сил делает AFM выгодным по сравнению с другими методами зондирования силы, такими как оптические/магнитные пинцеты и биомембранный зонд силы, так как они больше подходят для измерений слабой силы, с силой, как правило, менее 200 pN17 , 18. Кроме того, AFM может функционировать как высокоточный манипулятор для доставки различных стимулов на одиночные клетки в пространственно определенным образом4,19. Это желательно для проведения одноклеточных исследований в режиме реального времени. В сочетании с живой клеткой флуоресценции изображения, последующая клеточная реакция на конкретные стимулы могут контролироваться одновременно, что делает AFM основе SCFS чрезвычайно надежным, как оптические изображения, обеспечивая практический инструмент для зондирования клеточной сигнализации. Например, AFM был использован для определения штаммов, необходимых для получения преходящей кальция в остеобластах20. В этой работе, переходные кальция были отслежены флуоресцентно через кальций коэффициентметрической визуализации после применения локализованных сил на культивированных остеобластов с aFM отзыв. Недавно AFM был использован для растяжения колагенных фибрилков, на которых были выращены печеночные клетки стеллата (HSC), и эта механо-трансиндуцированная активация HSC в режиме реального времени контролировалась флуоресцентным биосенсором Src, фосфорилирование которого представлено Интенсивность флуоресценции биосенсора коррелирует с активацией HSC3.
В экспериментах SCFS на основе AFM правильная функционализация кантилеверов AFM является ключевым шагом на пути к успешным измерениям. Так как наш исследовательский интерес фокусируется на активации иммунных клеток, мы регулярно функционализируем кантилеверы с твердыми частицами, такими как отдельные твердые частицы, которые могут вызвать фагоцитоз и/или сильные иммунные реакции4,14 , 15 и одиночные Т-клетки, которые могут образовывать иммунный синапс с антигеном, представляя клетки, такие как активированные дендритные клетки (DC)2. Одиночные твердые частицы нормально соединены к cantilever через эпоксидный клей в окружающей среде воздуха, тогда как одиночные клетки T, из-за их non-клейкого природы, функционализированы к cantilever через биосовместимый клей в растворе. Здесь мы описываем методы выполнения этих двух типов модификации кантилевера и даем два связанных приложения. Первое приложение заключается в зондировании взаимодействий Т-клеток/DC с AFM-SCFS, чтобы понять подавляющий механизм регуляторных Т-клеток с точки зрения механики клеток. Второй включает в себя сочетание AFM с живой клеткой флуоресценции изображения для мониторинга клеточной реакции макрофага на твердую частицу в режиме реального времени, чтобы выявить молекулярный механизм рецептор-независимый фосфатидинозинол 4,5-бисфосфат (PIP2)- Моезин опосредованный фагоцитоз. Цель этого протокола заключается в том, чтобы обеспечить ориентировочную основу для заинтересованных исследователей для разработки и реализации своих собственных экспериментальных настроек с AFM на основе одноклеточного анализа для иммунологических исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Спектроскопия одноклеточной силы на основе AFM превратилась в мощный инструмент для решения биофизических свойств живых клеток. Для этих приложений, кантилевер должен быть функционировал должным образом для того, чтобы зондировать конкретные взаимодействия или свойства на клетках, пр…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается Национальным фондом естественных наук Китая Общей программы (31370878), Государственной ключевой программы (31630023) и Инновационной исследовательской группы программы (81621002).
Materials
| Material | |||
| 10 μl pipette tip | Thermo Fisher | 104-Q | |
| 15 ml tube | Corning | 430791 | |
| 6 cm diameter culture dish | NALGENE nunc | 150462 | |
| 6-well culture plate | JET | TCP011006 | |
| AFM Cantilever | NanoWorld | Arrow-TL1-50 | tipless cantilever |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | 7604 | |
| Biocompatible glue | BD Cell-Tak | 354240 | |
| CD4+ T cell isolation Cocktail | STEMCELL | 19852C.1 | |
| DC2.4 cell line | A gift from K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA) | ||
| Dextran-coated magnetic particles | STEMCELL | SV30010 | |
| EDTA | GENEray | Generay-E1101-500 ml | |
| Epoxy | ERGO | 7100 | |
| Ethanol | twbio | 00019 | |
| FBS | Ex Cell Bio | FSP500 | |
| FcR blocker | STEMCELL | 18731 | |
| Glass coverslip | local vender (Hai Men Lian Sheng) | HX-E37 | 24mm diameter, 0.17mm thinckness |
| Glass slides | JinTong department of laboratory and equipment management, Haimen | N/A | customized |
| H2O2 (30%) | Sino pharm | 10011218 | |
| H2SO4 | Sino pharm | 80120892 | |
| HEPES | Sigma | 51558 | |
| Magnet | STEMCELL | 18000 | |
| Mesh nylon strainer | BD Falcon | REF 352350 | |
| Moesin-EGFP | N/A | cloned in laboratory | |
| Mouse CD25 Treg cell positive isolation kit | STEMCELL | 18782 | Component: FcR Blocker,Regulatory T cell Positive Selection Cocktail, PE Selection Cocktail, Dextran RapidSpheres, |
| Mouse CD4+ Tcell isolation kit | STEMCELL | 19852 | Component:CD4+T cell isolation Cocktail, Streptavidin RapidSpheres, Rat Serum |
| NaOH | Lanyi chemical products co., LTD， Beijing | 1310-73-2 | |
| PBS | Solarbio | P1022-500 | |
| PE selection cocktail | STEMCELL | 18151 | |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| PLCδ-PH-mCherry | Addgene | 36075 | |
| Polystyrene microspheres 6.0μm | Polysciences | 07312-5 | |
| polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| Rat serum | STEMCELL | 13551 | |
| RAW264.7 | ATCC | ||
| Recombinant Human Interleukin-2 | Peprotech | Peprotech, 200-02-1000 | |
| Red blood cell lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Regulatory T cell positive selection cocktail | STEMCELL | 18782C | |
| RPMI 1640 | Life | C11875500BT | |
| Sample chamber | Home made | ||
| Streptavidin-coated magnetic particles | STEMCELL | 50001 | |
| Transfection kit | Clontech | 631318 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Life | 25200114 | |
| Tweezers | JD | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 20x objective NA 0.8 | Zeiss | 420650-9901 | Plan-Apochromat |
| Atomic force microscope | JPK | cellHesion200 | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Allegra X-12R | |
| Fluorescence imaging | home-made objective-type total internal reflection fluorescence microscop based on a Zeiss microscope stand | ||
| Humidified CO2 incubator | Thermo Fisher | HERACELL 150i | |
| Inverted light microscope | Zeiss | Observer A1 manual |
Referências
- Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).
- Chen, J., et al. Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 327-338 (2017).
- Liu, L., et al. Mechanotransduction-modulated fibrotic microniches reveal the contribution of angiogenesis in liver fibrosis. Nature Materials. 16 (12), 1252-1261 (2017).
- Mu, L. B., et al. A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate redistribution-based sensing mechanism initiates a phagocytosis programing. Nature Communications. 9, (2018).
- Qi, C., et al. Pathology-targeted cell delivery via injectable micro-scaffold capsule mediated by endogenous TGase. Biomaterials. 126, 1-9 (2017).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
- Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: a nanoscopic window on the cell surface. Trends in Cell Biology. 21 (8), 461-469 (2011).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysics Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
- Scheuring, S., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy: probing the spatial organization, interactions and elasticity of microbial cell envelopes at molecular resolution. Molecular Microbiology. 75 (6), 1327-1336 (2010).
- Berdyyeva, T. K., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements. Physics in Medicine and Biology. 50 (1), 81-92 (2005).
- Sokolov, I., Dokukin, M. E., Guz, N. V. Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments. Methods. 60 (2), 202-213 (2013).
- Bozna, B. L., et al. Binding strength and dynamics of invariant natural killer cell T cell receptor/CD1d-glycosphingolipid interaction on living cells by single molecule force spectroscopy. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 15973-15979 (2011).
- Flach, T. L., et al. Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity. Nature Medicine. 17 (4), 479-487 (2011).
- Ng, G., et al. Receptor-independent, direct membrane binding leads to cell-surface lipid sorting and Syk kinase activation in dendritic cells. Immunity. 29 (5), 807-818 (2008).
- Helenius, J., Heisenberg, C. P., Gaub, H. E., Muller, D. J. Single-cell force spectroscopy. Journal of Cell Science. 121 (11), 1785-1791 (2008).
- Litvinov, R. I., Shuman, H., Bennett, J. S., Weisel, J. W. Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7426-7431 (2002).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysics Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
- Lamprecht, C., Hinterdorfer, P., Ebner, A. Applications of biosensing atomic force microscopy in monitoring drug and nanoparticle delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (8), 1237-1253 (2014).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysics Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Sun, M. Z., et al. Multiple membrane tethers probed by atomic force microscopy. Biophysics Journal. 89 (6), 4320-4329 (2005).
- Yan, J. C., Liu, B., Shi, Y., Qi, H. Class II MHC-independent suppressive adhesion of dendritic cells by regulatory T cells in vivo. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 319-326 (2017).
- Hao, J. J., et al. Phospholipase C-mediated hydrolysis of PIP2 releases ERM proteins from lymphocyte membrane. Journal of Cell Biology. 184 (3), 451-462 (2009).
- Rodriguez, R. M., et al. Lymphocyte-T Adhesion to Fibronectin (Fn) – a Possible Mechanism for T-Cell Accumulation in the Rheumatoid Joint. Clinical and Experimental Immunology. 89 (3), 439-445 (1992).
- Kimura, A., Ersson, B. Activation of Lymphocytes-T by Lectins and Carbohydrate-Oxidizing Reagents Viewed as an Immunological Recognition of Cell-Surface Modifications Seen in the Context of Self Major Histocompatibility Complex Antigens. European Journal of Immunology. 11 (6), 475-483 (1981).
- Miller, K. The Stimulation of Human Lymphocyte-B and Lymphocyte-T by Various Lectins. Immunobiology. 165 (2), 132-146 (1983).
- Vitte, J., Pierres, A., Benoliel, A. M., Bongrand, P. Direct quantification of the modulation of interaction between cell- or surface-bound LFA-1 and ICAM-1. Journal of Leukocyte Biology. 76 (3), 594-602 (2004).
- Beaussart, A., et al. Quantifying the forces guiding microbial cell adhesion using single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 9 (5), 1049-1055 (2014).
- Shu, F., et al. Cholesterol Crystal-Mediated Inflammation Is Driven by Plasma Membrane Destabilization. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Hosseini, B. H., et al. Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17852-17857 (2009).
