Nós descrevemos protocolos para preparar ooocysts e purificar esporozoítos para estudar a infecção de organóides intestinais e da via aérea humanos pelo parvum de Cryptosporidium. Nós demonstramos os procedimentos para o microinjection dos parasita no lúmen organoid intestinal e na imunocoloração dos organoids. Finalmente, nós descrevemos o isolamento de ooocysts gerados dos organoids.
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Artigo de método
Estudando infecção por Cryptosporidium em sistemas de cultura Organóide humano derivado do tecido 3D por microinjeção
Neste artigo
Resumo
Resumo
O parvum de Cryptosporidium é uma das causas principais da doença diarreicas humana. Para compreender a patologia do parasita e desenvolver drogas eficientes, um sistema in vitro da cultura que recapitula as circunstâncias no anfitrião é necessário. Organóides, que se assemelham estreitamente aos tecidos de sua origem, são ideais para estudar interações hospedeiro-parasita. Os organóides são estruturas derivadas de tecido tridimensionais (3D) derivadas de células-tronco adultas e crescem em cultura por longos períodos de tempo sem sofrer qualquer aberração genética ou transformação. Têm a polaridade bem definida com superfícies apical e basolateral. Organóides têm várias aplicações em testes de drogas, biobancário, e modelagem de doenças e estudos de interação hospedeiro-micróbio. Aqui nós apresentamos um protocolo passo a passo de como preparar os oocistos e os esporozoítos do Cryptosporidium para infectar organoids intestinais e da via aérea humana. Nós demonstramos então como a microinjeção pode ser usada para injetar os micróbios no lúmen organoid. Existem três métodos principais pelos quais os organóides podem ser usados para estudos de interação hospedeiro-micróbe — microinjeção, cisalhamento mecânico e chapeamento, e fazendo monolayers. Microinjection permite a manutenção da estrutura 3D e permite o controle preciso de volumes do parasita e de contato lateral apical direto para os micróbios. Nós fornecemos detalhes para o crescimento ideal dos organóides para a produção da imagem latente ou do ooocyst. Finalmente, nós igualmente demonstramos como os ooocysts recentemente gerados podem ser isolados do organoid para um processamento e uma análise a jusante mais adicionais.
Introdução
O desenvolvimento de medicamentos ou vacinas para tratamento e prevenção da infecção por Cryptosporidium tem sido dificultado pela falta de sistemas in vitro que imitam precisamente a situação in vivo em humanos1,2. Muitos dos sistemas atualmente disponíveis permitem apenas a infecção a curto prazo (< 5 dias) ou não suportam o ciclo de vida completo do parasita3,4. Outros sistemas que permitam o desenvolvimento completo do parasita são baseados em linhas celulares imortalizadas ou linhas de células cancerosas que não recapitulam fielmente a si....
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Protocolo
Toda a manipulação e Resection do tecido foram executados protocolos aprovados da placa de revisão institucional (IRB) com consentimento paciente.
1. preparação de oocistos de C. parvum para injeção
Nota: Os oocistos de Cryptosporidium foram adquiridos de uma fonte comercial (ver a tabela de materiais). Estes oocistos são produzidos em bezerros e são armazenados em soro-tampão fosfato (PBS) com antibióticos. Eles podem ser armazenados por cerca de 3 meses a 4 ° c e nunca devem ser congelados. Nós normalmente usamos oocistos dentro de um mês. Os organóides podem se....
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Resultados
Os protocolos aqui apresentados resultam na purificação eficiente de oocistos e esporozoítos (Figura 1a) prontos para a microinjeção. O protocolo do excistação conduz à liberação dos esporozoítos de aproximadamente 70 – 80% dos ooocysts, conseqüentemente é essencial filtrar para fora os ooocysts e os escudos restantes através de um filtro de 3 μm. A filtração resulta em quase 100% de purificação de esporozoíta (Figura 1b). Além disso, a adição de um corante verd.......
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Discussão
A cultura de parasitas de Cryptosporidium em organóides intestinais e de vias aéreas fornece um modelo preciso para estudar interações parasita-hospedeiro10 , mas também tem muitas outras aplicações. Por exemplo, os métodos atuais de seleção e propagação de parasitas de Cryptosporidium geneticamente modificados necessitam de passagem em camundongos19 , o que não permite o isolamento de parasitas que têm modificações essenciais para a infecção in vivo. A cu.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos a Deborah a. Schaefer, da escola de Ciências Biomédicas de animais e comparativos, da faculdade de agricultura e ciências biológicas da Universidade do Arizona, Tucson, AZ, EUA, por nos ajudar com a produção e análise do oocisto. Nós igualmente Agradecemos o centro da microscopia e da imagem latente de Franceschi e o DL Mullendore na Universidade de estado de Washington para a preparação e a imagem latente de ooocysts organoid isolados.
D.D. é o beneficiário de um subsídio de VENI da organização neerlandesa para a investigação científica (NWO-ALW, 016. Veni. 171.015). I.H. é o beneficiário de uma subvenção VENI da organização ne....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Extrato de membrana basal (matriz extracelular) | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo anticorpo (anticorpo específico para Oocyst) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Concentração Final = Use 2-3 gotas/lâmina |
| Contas magnéticas revestidas com IgM Crypto-Grab | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 rack | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 rack | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Filtros de Membrana de Policarbonato Isopore - 3µ m | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Corante verde rápido | SIGMA | F7252-5G | |
| Microinjetor Femtojet 4i | Eppendorf | 5252000013 | |
| Capilares de vidro de 1 mm de diâmetro | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel (matriz extracelular) | Corning | 356237 | |
| Tubo de microfuga 1.5 mL | Eppendorf | T9661-1000EA& | nbsp; |
| Pontas de micro-carregador | Eppendorf | 612-7933 | |
| Extrator de micropipetas P-97 | Instrumento de obturador | P-97 | |
| Soro de burro normal | Bio-Rad | C06SB& | nbsp; |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Hipoclorito de sódio (use 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Slides super stick | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47 mm Suporte de filtro de policarbonato | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Ácido taurocólico de hidrato de sal de sódio | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Agente de montagem Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Quantidade final | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500 mL |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5 mL de estoque em 500 mL DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5 mL de estoque em 500 mL DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5 mL de estoque em 500 mL DMEM |
| MEIO ORGANOIDE INTESTINAL-OME (Meio de expansão) | Concentração final | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0,5 µ M |
| Adv+++ | perfazer até 100 ml | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1x |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1.25 |
| mM NIC | Sigma | N0636-100G | 10 mM |
| Noggin CM | In house* | 10% de sucesso | |
| Inibidor de P38 (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10 µ M |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1 mL/500 mL de mídia |
| RSpoI CM | In house* | 20% de sucesso | |
| Wnt3a CM | Em casa* | 50% de sucesso | |
| In house* - linhas celulares serão fornecidas mediante solicitação | |||
| MEIO ORGANOIDE INTESTINAL-OMD (Meio de diferenciação) | Para diferenciar os organoides, os organoides do intestino delgado em expansão foram cultivados em meio rico em Wnt por seis a sete dias após a divisão e, em seguida, cultivados em meio de diferenciação (retirada de Wnt, nicotinamida, SB202190, em meio de diferenciação (retirada de Wnt, nicotinamida, SB202190, prostaglandina E2 de um meio rico em Wnt ou OME) | ||
| MEIOS ORGANOIDES PULMONARES (meios de diferenciação) | Concentração final | ||
| Adv+++ | perfazer até 100 ml | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500 nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0,0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25 ng/mL |
| N-Acetilcisteína | Sigma | A9125-25G | 1,25 mM |
| Nicotinamida | Sigma | N0636-100G | 5 mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Entre em contato diretamente com a empresa | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1 µ M |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2.5 µ m |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Entre em contato direto com a empresa | 10% |
| Reducing buffer (para ressuspensão de oocistos e esporozoítos para injeção) | < / forte > | < forte > concentração final< / forte > | |
| L-glutationa reduzida | Sigma | G4251-10MG | 0,5 μ g/μ L de OME/OMD/LOM |
| Betaína | Sigma | 61962 | 0.5 μ g/μ L de OME/OMD/LOM |
| L-Cisteína | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μ g/μ L de OME / OMD / LOM |
| Ácido linoléico | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μ g/mL de OME/OMD/LOM |
| Taurina | Sigma | T0625-10MG | 0,5 μ g/μ L de OME/OMD/LOM |
| Blocking buffer (para coloração de imunofluorescência) | Concentração final | ||
| Soro de burro/cabra | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Composição até 100 mL |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0,1% |
| Lista de anticorpos usados | |||
| Alexa 568 cabra anti-coelho | Invitrogen | A-11011 | Diluição-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Anticorpo marcado com fluoresceína Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Diluição- 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads- Grânulos magnéticos revestidos em anticorpo monoclonal reativo | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Diluição-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Diluição-1:1,000; RRID: AB_2629482 |
| Faloidina-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Diluição-1:1.000; RRID: AB_2620155 |
| anticorpo anti-gp15 de coelho gerado por R. M. O' Connor (co-autor). | Mediante solicitação | Mediante solicitação | Diluição-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Diluição- 1:200 |
Referências
- Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
- Bones, A. J., et al.
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Reimpressões e permissões
