Un jeu d'enfant pour quantifier la liaison protéine-ARN chez les bactéries
Summary
Dans cette méthode, nous quantifions l’affinité de liaison des protéines de liaison d’ARN (RBPs) aux emplacements de liaison de cognate et non-cognate utilisant un simple, vivant, test de journaliste dans les cellules bactériennes. L’exemple est basé sur la répression d’un gène journaliste.
Abstract
Dans l’étape d’initiation de la traduction de protéine, le ribosome se lie à la région d’initiation de l’ARNm. L’initiation à la traduction peut être bloquée par la liaison d’une protéine de liaison de l’ARN (RBP) à la région d’initiation de l’ARNm, qui interfère avec la liaison ribosome. Dans la méthode présentée, nous utilisons ce phénomène de blocage pour quantifier l’affinité contraignante des RRP à leurs sites de liaison cognate et non cognate. Pour ce faire, nous insérons un site de liaison de test dans la région d’initiation d’un ARNm journaliste et induisons l’expression du test RBP. Dans le cas de la liaison RBP-ARN, nous avons observé une répression sigmoïdale de l’expression du journaliste en fonction de la concentration du RBP. Dans le cas de l’absence d’affinité ou d’une très faible affinité entre le site de liaison et le RBP, aucune répression significative n’a été observée. La méthode est réalisée dans des cellules bactériennes vivantes, et ne nécessite pas de machinerie coûteuse ou sophistiquée. Il est utile pour quantifier et comparer entre les affinités de liaison de différents RBP qui sont fonctionnels dans les bactéries à un ensemble de sites de liaison conçus. Cette méthode peut être inappropriée pour lier les sites à forte complexité structurelle. Cela est dû à la possibilité de répression de l’initiation ribosomale par la structure complexe de l’ARNm en l’absence de RBP, ce qui se traduirait par une expression plus faible du gène journaliste basique, et donc moins observable journaliste répression sur RBP liaison.
Introduction
La régulation post-transcriptionnelle basée sur la protéine de liaison d’ARN (RBP), spécifiquement la caractérisation de l’interaction entre RBPs et ARN, a été étudiée intensivement au cours des dernières décennies. Il existe de multiples exemples de régulation translationnelle des bactéries provenant de RRP inhibant, ou en concurrence directe avec, la liaison ribosome1,2,3. Dans le domaine de la biologie synthétique, les interactions RBP-ARN apparaissent comme un outil important pour la conception de circuits génétiques basés sur la transcription4,5. Par conséquent, il y a une augmentation de la demande pour la caractérisation de telles interactions RBP-ARN dans un contexte cellulaire.
Les méthodes les plus courantes pour étudier les interactions protéine-ARN sont l’analyse de changement de mobilité électrophorétique (EMSA)6, qui est limitée aux paramètres in vitro, et divers essais de tractionvers lebas 7 , y compris la méthode CLIP8,9 . Bien que ces méthodes permettent la découverte de sites de liaison de l’ARN de novo, elles souffrent d’inconvénients tels que des protocoles à forte intensité de main-d’œuvre et des réactions coûteuses de séquençage profond et peuvent nécessiter un anticorps spécifique pour le retrait du RBP. En raison de la nature sensible de l’ARN à son environnement, de nombreux facteurs peuvent affecter les interactions RBP-ARN, soulignant l’importance d’interroger la liaison RBP-ARN dans le contexte cellulaire. Par exemple, nous et d’autres avons démontré des différences significatives entre les structures de l’ARN in vivo et in vitro10,11.
Basé sur l’approche d’une étude précédente12, nous avons récemment démontré10 que lors du placement de sites de liaison pré-conçus pour les RRP capsides des bactériophages GA13, MS214, PP715, et Q16 dans le région d’initiation de traduction d’un ARNm de journaliste, l’expression de journaliste est fortement réprimée. Nous présentons une méthode relativement simple et quantitative, basée sur ce phénomène de répression, pour mesurer l’affinité entre les RBP et leur site de liaison d’ARN correspondantde vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite dans cet article facilite la mesure in vivo quantitative de l’affinité de liaison RBP-ARN dans les cellules de E. coli. Le protocole est relativement facile et peut être effectué sans l’utilisation de machines sophistiquées, et l’analyse des données est simple. En outre, les résultats sont produits immédiatement, sans le temps d’attente relativement long associé aux résultats du séquençage de la prochaine génération (NGS).
Une limitation à cette mét…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a reçu un financement du programme I-CORE du Comité de planification et de budget et de la Fondation des sciences israéliennes (Grant no 152/11), Marie Curie Reintegration Grant No. PCIG11-GA- 2012-321675, et du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de l’accord de subvention no 664918 – MRG-Grammar.
Materials
| Ampicillin sodium salt | SIGMA | A9518 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | ALFA AESAR | 33337 | |
| 48 plates | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
| 8- lane plates | Axygen | RESMW8I | |
| 96-well plates | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well plates for plate reader | Perkin Elmer | 6005029 | |
| ApaLI | NEB | R0507 | |
| Binding site sequences | Gen9 Inc. and Twist Bioscience | see Table 1 | |
| E. coli TOP10 cells | Invitrogen | C404006 | |
| Eagl-HF | NEB | R3505 | |
| glycerol | BIO LAB | 071205 | |
| incubator | TECAN | liconic incubator | |
| Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
| KpnI- HF | NEB | R0142 | |
| ligase | NEB | B0202S | |
| liquid-handling robotic system | TECAN | EVO 100, MCA 96-channel | |
| Matlab analysis software | Mathworks | ||
| multi- pipette 8 lanes | Axygen | BR703710 | |
| N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) | cayman | K40982552 019 | |
| PBS buffer | Biological Industries | 020235A | |
| platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
| Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
| RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | see Table 2 |
| SODIUM CHLORIDE (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
| SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Tryptone | BD | 211705 |
Referências
- Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein. Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).
- Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. Regulation of translation initiation by RNA binding proteins. Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).
- Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria. Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).
- Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future. Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).
- Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).
- Bendak, K., et al. A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein. Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).
- Strein, C., Alleaume, A. -. M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells. RNA. 20 (5), 721-731 (2014).
- Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
- Lee, F. C. Y., Ule, J. Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions. Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).
- Katz, N., et al. An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).
- Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Methods. 103, 34-48 (2016).
- Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
- Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA. Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).
- Peabody, D. S. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein. The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).
- Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
- Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. The RNA-binding Site of Bacteriophage Qβ Coat Protein. Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- . Optimizing Restriction Endonuclease Reactions Available from: https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions (2018)
- . Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol Available from: https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/ (2018)
- . Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202) Available from: https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202 (2018)
- . Routine Cloning Using Top10 Competent Cells – US Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html (2018)
- . NucleoSpin Plasmid – plasmid Miniprep kit Available from: https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx (2018)
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- . Protocol – How to Create a Bacterial Glycerol Stock Available from: https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/ (2018)
- . Making your own chemically competent cells Available from: https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells (2018)
- . Luria-Bertani (LB) Medium Preparation · Benchling Available from: https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation (2018)
- Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo. Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).
- Espah Borujeni, A., et al. Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences. Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).
- Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505, (2013).
- Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
- Lucks, J. B., et al. Multiplexed RNA structure characterization with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).
- Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486 (2015).
- Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq. Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).
- Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).
- Bernardi, A., Spahr, P. -. F. Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).
