बैक्टीरिया में प्रोटीन-आरएनए बाइंडिंग की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक परख
Summary
इस विधि में, हम आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन (RBPs) की बाध्यकारी समानता को एक सरल, लाइव, रिपोर्टर परख का उपयोग करके एक सरल, लाइव, रिपोर्टर परख का उपयोग करने के लिए cognate और गैर-cognate बाध्यकारी साइटों के लिए परिमाणित. परख एक पत्रकार जीन के दमन पर आधारित है.
Abstract
प्रोटीन अनुवाद की दीक्षा चरण में, राइबोसोम MRNA के दीक्षा क्षेत्र के लिए बांधता है. अनुवाद दीक्षा MRNA के दीक्षा क्षेत्र के लिए एक आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन (RBP) के बंधन द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है, जो राइबोसोम बंधन के साथ हस्तक्षेप. प्रस्तुत विधि में, हम इस अवरुद्ध घटना का उपयोग करने के लिए उनके cognate और गैर cognate बाध्यकारी साइटों के लिए RBPs के बाध्यकारी संबंध मात्रा. ऐसा करने के लिए, हम एक पत्रकार MRNA के दीक्षा क्षेत्र में एक परीक्षण बाइंडिंग साइट डालने और परीक्षण RBP की अभिव्यक्ति प्रेरित. RBP-RNA बाइंडिंग के मामले में, हमने रिपोर्टर अभिव्यक्ति के एक सिग्मोइडल दमन को आरबीपी सांद्रता के एक समारोह के रूप में देखा। बाध्यकारी साइट और आरबीपी के बीच कोई आत्मीयता या बहुत कम आत्मीयता के मामले में, कोई महत्वपूर्ण दमन नहीं देखा गया था। विधि लाइव जीवाणु कोशिकाओं में किया जाता है, और महंगी या परिष्कृत मशीनरी की आवश्यकता नहीं है। यह विभिन्न RBPs है कि बैक्टीरिया में काम कर रहे हैं डिजाइन बाध्यकारी साइटों का एक सेट करने के लिए बाध्यकारी सजातीयता के बीच परिमाणीकरण और तुलना के लिए उपयोगी है. इस विधि उच्च संरचनात्मक जटिलता के साथ बाध्यकारी साइटों के लिए अनुपयुक्त हो सकता है. यह आरबीपी के अभाव में जटिल एमआरएनए संरचना द्वारा राइबोसोमल दीक्षा के दमन की संभावना के कारण है, जिसके परिणामस्वरूप कम बेसल रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति होगी, और इस प्रकार आरबीपी बाइंडिंग पर कम-देखने योग्य रिपोर्टर दमन होगा।
Introduction
आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन (आरबीपी) आधारित पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन, विशेष रूप से आरबीपी और आरएनए के बीच बातचीत की विशेषता, हाल के दशकों में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। आरबीपीएस से निकलने वाले बैक्टीरिया में अनुवादात्मक डाउन-विनियमन के कई उदाहरण हैं जो बाधा उत्पन्न करते हैं, या सीधे प्रतिस्पर्धा करते हैं, राइबोसोम बंधन1,2,3. संश् लेषित जीव विज्ञान के क्षेत्र में आरबीपी-आर.एन.ए. अन्तरक्रिया प्रतिलेखन-आधारित आनुवंशिक परिपथों4,5के डिजाइन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में उभर रहे हैं। इसलिए, एक सेलुलर संदर्भ में ऐसे आरबीपी-आरएनए इंटरैक्शन की विशेषता की मांग में वृद्धि हुई है।
प्रोटीन-आरएनए बातचीत के अध्ययन के लिए सबसे आम तरीके इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता पारी परख (EMSA)6, जो इन विट्रो सेटिंग्स में करने के लिए सीमित है, और विभिन्न पुल-डाउन परख7, CLIP विधि8सहित,9 . जबकि इस तरह के तरीकों de नोवो आरएनए बाध्यकारी साइटों की खोज सक्षम, वे इस तरह के श्रम गहन प्रोटोकॉल और महंगी गहरी अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं के रूप में कमियों से ग्रस्त हैं और RBP पुल-डाउन के लिए एक विशिष्ट एंटीबॉडी की आवश्यकता हो सकती है. आरएनए की अतिसंवेदनशील प्रकृति के कारण, कई कारक RBP-RNA बातचीत को प्रभावित कर सकते हैं, सेलुलर संदर्भ में RBP-RNA बाध्यकारी पूछताछ के महत्व पर बल. उदाहरण के लिए, हमने और अन्य ने विवो में आरएनए संरचनाओं और विट्रो10,11में महत्वपूर्ण अंतरों का प्रदर्शन किया है।
एक पिछले अध्ययन12के दृष्टिकोण के आधार पर, हम हाल ही में10 का प्रदर्शन किया है कि जब बैक्टीरियोफेज GA13से capsid RBPs के लिए पूर्व डिजाइन बाध्यकारी साइटों रखने , MS214, PP715, और क्यू में16 एक पत्रकार MRNA के अनुवाद दीक्षा क्षेत्र, रिपोर्टर अभिव्यक्ति दृढ़ता से दमित है. हम एक अपेक्षाकृत सरल और मात्रात्मक विधि प्रस्तुत, इस दमन घटना के आधार पर, RBPs और उनके इसी आरएनए बाध्यकारी साइटके बीच संबंध को मापने के लिए vivo में.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अनुच्छेद में वर्णित विधि ई. कोलाई कोशिकाओं में आरबीपी-आरएनए बंधनात्मक संबंध के विवो माप में मात्रात्मक की सुविधा प्रदान करती है। प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत आसान है और परिष्कृत मशीनरी के उपयोग के बिन…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना की योजना और बजट समिति और इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (ग्रेंट नंबर 152/11), मैरी क्यूरी पुन: एकीकरण अनुदान No. के आई-कोर कार्यक्रम से धन प्राप्त किया। PCIG11-GA- 2012-321675, और अनुदान समझौते के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से संख्या 664918 – MRG-Grammar.
Materials
| Ampicillin sodium salt | SIGMA | A9518 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | ALFA AESAR | 33337 | |
| 48 plates | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
| 8- lane plates | Axygen | RESMW8I | |
| 96-well plates | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well plates for plate reader | Perkin Elmer | 6005029 | |
| ApaLI | NEB | R0507 | |
| Binding site sequences | Gen9 Inc. and Twist Bioscience | see Table 1 | |
| E. coli TOP10 cells | Invitrogen | C404006 | |
| Eagl-HF | NEB | R3505 | |
| glycerol | BIO LAB | 071205 | |
| incubator | TECAN | liconic incubator | |
| Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
| KpnI- HF | NEB | R0142 | |
| ligase | NEB | B0202S | |
| liquid-handling robotic system | TECAN | EVO 100, MCA 96-channel | |
| Matlab analysis software | Mathworks | ||
| multi- pipette 8 lanes | Axygen | BR703710 | |
| N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) | cayman | K40982552 019 | |
| PBS buffer | Biological Industries | 020235A | |
| platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
| Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
| RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | see Table 2 |
| SODIUM CHLORIDE (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
| SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Tryptone | BD | 211705 |
Referências
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