Um ensaio para quantificar a ligação de RNA de proteína em bactérias

Summary

Neste método, nós quantificamos a afinidade obrigatória de proteínas de ligação do RNA (rbps) aos locais de ligação cognato e non-cognato usando um simples, vivo, ensaio do repórter em pilhas bacterianas. O ensaio é baseado na repressão de um gene repórter.

Abstract

No passo de iniciação da tradução da proteína, o Ribossome liga-se à região de iniciação do mRNA. A iniciação da tradução pode ser obstruída pela ligação de uma proteína obrigatória do RNA (RBP) à região de iniciação do mRNA, que interfere com o emperramento ribossoma. No método apresentado, utilizamos este fenômeno de bloqueio para quantificar a afinidade vinculativa de RBPs aos seus locais de ligação cognato e não cognato. Para fazer isso, inserimos um site de vinculação de teste na região de iniciação de um mRNA de repórter e induzem a expressão do teste RBP. No caso da Associação RBP-RNA, observou-se uma repressão sigmoidal da expressão repórter em função da concentração de RBP. No caso de não afinidade ou de afinidade muito baixa entre o local de ligação e a RBP, não foi observada nenhuma repressão significativa. O método é realizado em células bacterianas ao vivo, e não requer maquinaria dispendiosa ou sofisticada. É útil para quantificar e comparar entre as afinidades de ligação de RBPs diferentes que são funcionais nas bactérias a um jogo de locais de ligação projetados. Este método pode ser inadequado para sites de ligação com alta complexidade estrutural. Isto é devido à possibilidade da repressão da iniciação ribosomal pela estrutura complexa do mRNA na ausência de RBP, que conduziria à expressão de gene mais baixa do repórter basal, e assim à repressão menos-Observable do repórter em cima da ligação de RBP.

Introduction

A regulação pós-transcricional de proteína de ligação de RNA (RBP), especificamente a caracterização da interação entre RBPs e RNA, tem sido extensivamente estudada nas últimas décadas. Existem vários exemplos de baixo-regulação translacional em bactérias originárias da inibição do rbps, ou diretamente competindo com, ligação Ribossome^1,2,3. No campo da biologia sintética, as interações RBP-RNA estão surgindo como uma ferramenta significativa para o desenho de circuitos genéticos baseados em transcrição^4,5. Portanto, há um aumento na demanda para caracterização dessas interações RBP-RNA em um contexto celular.

Os métodos mais comuns para o estudo das interações proteína-RNA são o ensaio eletroforético de deslocamento de mobilidade (EMSA)⁶, que é limitado a configurações in vitro, e vários ensaios pull-down⁷, incluindo o método de clipe^8,9 . Quando tais métodos permiterem a descoberta de locais de ligação do RNA de de novo, sofrem dos inconvenientes tais como protocolos labor-intensivos e de reações de seqüenciamento profundas caras e podem exigir um anticorpo específico para a tração-para baixo de RBP. Devido à natureza suscetível do RNA ao seu ambiente, muitos fatores podem afetar as interações RBP-RNA, enfatizando a importância de interrogar a ligação RBP-RNA no contexto celular. Por exemplo, nós e outros temos demonstrado diferenças significativas entre as estruturas de RNA in vivo e in vitro^10,11.

Baseado na aproximação de um estudo precedente¹², Nós demonstramos recentemente¹⁰ que ao coloc locais obrigatórios pre-projetados para o capsídeo rbps dos bacteriófagos GA¹³, MS2¹⁴, PP7¹⁵, e qβ¹⁶ no região de iniciação de tradução de um repórter mRNA, a expressão do repórter é fortemente reprimido. Nós apresentamos um método relativamente simples e quantitativo, baseado neste fenômeno da repressão, para medir a afinidade entre RBPs e seu local de ligação RNA correspondentes in vivo.

Protocol

1. preparação do sistema Projeto de plasmídeos do ligação-local Projete a gaveta do local de ligação como representado na Figura 1. Cada que contém as seguintes peças (5 ‘ a 3 ‘): Eagl local de restrição, ~ 40 bases do 5 ‘ fim do canamicina (Kan) gene de resistência, pLac-ara promotor, Ribossoma Binding site (RBS), Aug do gene mcherry, um espaçador (δ), um local de ligação RBP, 80 bases do 5 ‘ final do gene mCherry, e um local de restriç?…

Representative Results

O método apresentado utiliza a competição entre uma RBP e o Ribossome para ligação à molécula de mRNA (Figura 1). Esta competição é refletida pela diminuição dos níveis de mCherry em função do aumento da produção de RBP-mCerulean, devido ao aumento das concentrações de indutor. No caso de aumento da fluorescência de mCerulean, sem alterações significativas em mCherry, a falta de ligação à RBP é deduzada. Os resultados representativos…

Discussion

O método descrito neste artigo facilita a medida in vivo quantitativa da afinidade obrigatória da RBP-RNA em pilhas de E. coli . O protocolo é relativamente fácil e pode ser conduzido sem o uso de maquinaria sofisticada, e a análise de dados é direta. Além disso, os resultados são produzidos imediatamente, sem o tempo de espera relativamente longo associado com os resultados de sequenciamento da próxima geração (NGS).

Uma limitação a este método é que trabalha somente e…

Materials

Ampicillin sodium salt	SIGMA	A9518
Magnesium sulfate (MgSO4)	ALFA AESAR	33337
48 plates	Axygen	P-5ML-48-C-S
8- lane plates	Axygen	RESMW8I
96-well plates	Axygen	P-DW-20-C
96-well plates for plate reader	Perkin Elmer	6005029
ApaLI	NEB	R0507
Binding site sequences	Gen9 Inc. and Twist Bioscience		see Table 1
E. coli TOP10 cells	Invitrogen	C404006
Eagl-HF	NEB	R3505
glycerol	BIO LAB	071205
incubator	TECAN	liconic incubator
Kanamycin solfate	SIGMA	K4000
KpnI- HF	NEB	R0142
ligase	NEB	B0202S
liquid-handling robotic system	TECAN	EVO 100, MCA 96-channel
Matlab analysis software	Mathworks
multi- pipette 8 lanes	Axygen	BR703710
N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL)	cayman	K40982552 019
PBS buffer	Biological Industries	020235A
platereader	TECAN	Infinite F200 PRO
Q5 HotStart Polymerase	NEB	M0493
RBP seqeunces	Addgene	27121 & 40650	see Table 2
SODIUM CHLORIDE (NaCL)	BIO LAB	190305
SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9281
Tryptone	BD	211705